深入浅出解读单细胞转录组测序技术路线

单细胞研究您该知道的事~

人们对细胞的认识可以从1665年Robert Hooke发现细胞说起，科学家们对植物细胞和动物细胞展开了进一步的观察研究，并由Schleiden和Schwann最早创立细胞学说，直到19世纪中期该学说才得以完善。从这些研究结论中我们认知到细胞是生物体结构和功能的基本单位，每个细胞有独特的表型和生物学功能，细胞之间存在异质性，这也正是细胞作为生命科学研究的最基本单位的意义所在。

相同或不同组织、器官、系统中的细胞均存在异质性，这不仅体现在形态结构上，由于细胞的命运由遗传物质决定，其本质差异更体现在基因组、转录组、表观组等层面，因此可对不同组学展开单细胞研究。其优势在于能够避免Bulk样本的均质化掩盖单细胞的异质性，可以在单细胞水平深入探索健康生理和疾病异常下的细胞状态，以了解生物体的功能机制和发现更为有效的疾病治疗方法。

近几十年来，人们一直围绕单细胞进行研究，2013年，单细胞DNA测序和单细胞RNA测序曾被Nature Methods评为年度技术；2016年，大型国际合作项目“人类细胞图谱计划”（The Human Cell Atlas）启动，该项目根据独特的分子信息（如基因表达）对所有人类细胞种类进行定义，并将这些信息与传统的细胞学表述（如位置和形态）相关联，在全球掀起了单细胞研究的热潮，尤其单细胞转录组测序是目前单细胞研究最热门的方向。

单细胞转录组测序

最早的单细胞组转录组技术只能检测单个细胞中的少数基因，细胞和基因的通量都比较低^[1]，后来通过结合芯片技术使细胞和基因的通量有所提升^[2,3]，直到2009年汤富酬^[4]将单细胞转录组与高通量测序结合时，基因检测通量才大大提升，比芯片能检测更多的转录本，这也是单细胞转录组测序的雏形，在此基础上细胞分离技术和检测技术等不断得到提升改进，逐渐发展出现今比较成熟的技术。

单细胞转录组测序的技术路线大致为：

1.细胞分离

单细胞转录组研究面临的一大技术难题是如何提升细胞通量，关键的技术突破是需要实现自动分离单细胞、从单个细胞中非定向扩增整个转录组、提升并行处理多个细胞的能力。从最初的人工手动分离如显微吸取法、激光显微切割法等，发展到自动化的集成流体电路、液滴微流控技术等，细胞通量从个位数跳跃到数万个细胞的数量级。分离得到的单细胞需要进一步保证拥有各自独立的微反应体系，比如微孔板利用孔间隔离、液滴微流控利用油滴包裹单细胞隔离。

2.单细胞标记

细胞标记是利用十多个碱基的核苷酸序列作为标签（Barcode），在单细胞微反应体系的逆转录过程中进行标记，同一个细胞内的所有转录本标记上相同的Barcode，这样在后续建库时能够混合操作，在数据分析层面也能够达到区分单细胞表达谱数据的目的，如STRT-seq^[5]、CEL-seq^[6]等。随着技术的升级，后来又引入了单细胞转录本UMI（Unique Molecular Identifier）标记，以解决PCR Bias对基因表达定量的影响，使基因定量更加精确，如CEL-seq2^[7]、Drop-seq^[8]。逆转录-标记之后得到cDNA链，进一步基于PCR或IVT技术对cDNA扩增以达到二代测序的要求。

3.基因检测

对于检测的基因类型，目前单细胞转录组测序是通过Poly（dT）捕获携带Poly（A）的RNA分子，主要检测mRNA和很少部分的lncRNA，检测的基因区域范围一般是3’ 端50-100 bp左右，对中高表达的基因较为敏感。Smart-seq2与STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq等技术相比能够检测mRNA的全长信息，获得较多的基因数目，但该技术仍存在细胞通量低、成本较高的缺点，不适合大规模的单细胞研究。

4.数据分析

高通量单细胞转录组测序在数据分析上有一定的套路可循：