结直肠癌患者相关的血浆和组织特异性miRNA表达模式及功能分析

lasma and Tissue Specific miRNA Expression Pattern and Functional Analysis Associated to Colorectal Cancer Patients6.162

Cancers (Basel) . 2020 Mar 31;12(4):843. doi: 10.3390/cancers12040843.

Abstract

An increasing number of studies suggest the implication of microRNAs (miRNAs) in colorectal (CRC) carcinogenesis and disease progression. Nevertheless, the basic mechanism is not yet clear. We determined plasma miRNA expression levels using Agilent microarray technology followed by overlapping with The Cancer Genome Atlas (TCGA) tissue data and a qRT-PCR validation step and analysis of the altered miRNA signatures to emphasize new mechanistic insights. For TGCA dataset, we identified 156 altered miRNAs (79 downregulated and 77 upregulated) in colorectal tissue samples versus normal tissue. The microarray experiment is based on 16 control samples, 38 CRC plasma samples from colorectal cancer patients who have not undergone chemotherapy, and 17 chemo-treated samples. In the case of the analysis of CRC cancer versus healthy control we identified 359 altered miRNAs (214 downregulated and 60 upregulated), considering as the cutoff value a fold-change of ±1.5 and p < 0.01. An additional microarray analysis was performed on plasma from untreated colorectal cancer (n = 38) and chemotherapy-treated colorectal cancer patients (n = 17), which revealed 15 downregulated miRNAs and 53 upregulated miRNAs, demonstrating that the plasma miRNA pattern is affected by chemotherapy and emphasizing important regulators of drug resistance mechanisms. For the validation of the microarray data, we selected a panel of 4 miRNAs from the common miRNA signatures for colon and rectal cancer (miR-642b-3p, miR-195-5p and miR-4741). At the tissue level, the expression levels were in agreement with those observed in colorectal plasma. miR-1228-3p, the top upregulated miRNA in CRC, was chosen to be validated on tissue and plasma samples, as it was demonstrated to be downregulated at tissue level in our patient cohort. This was confirmed by TCGA data and was one example of ta ranscript that has a different expression level between tumor tissue and plasma. Developing more efficient investigation methods will help explain the mechanisms responsible for miRNAs released in biofluids, which is the most upregulated transcript in colorectal plasma samples and which can function as a prediction tool within the oncological field.

Keywords: biomarker; colorectal cancer; miRNA; microarray; plasma.

一．研究背景
结直肠癌(CRC)是影响整个消化道最常见的肿瘤，已经有越来越多的研究表明，microRNAs (miRNAs)在结直肠癌的癌变和疾病进展中起到重要作用。然而，其涉及到的基本机制尚不清楚，而了解miRNA表达的调控有助于识别癌症中与治疗反应以及耐药行为启动相关的生物标志物。因此这篇文章研究的主要目的是评估血浆miRNAs，并将其与组织中发现的表达水平进行比较，以识别结肠直肠癌特异性miRNAs。
二．材料及方法
1) 数据：研究收集TCGA中444例结肠腺癌(COAD)和161例直肠腺癌(READ)的表达数据及临床信息。研究也对38例无化疗(CT)、17例有CT的结直肠癌患者和16例健康对照样本进行微阵列芯片研究，并收集了临床信息。
2) 结直肠癌患者和健康对照组的血浆制备和RNA分离：收集患者初诊的外周血样本，使用Plasma/Serum Circulating和Exosomal RNA Purification Kit提取血浆miRNA。
3) miRNA 微阵列芯片评估
4) 芯片数据分析
5) miRNA RT-PCR：执行RT-PCR检测在微阵列实验中观察到的差异表达的候选miRNA，并用ROC曲线评估敏感性和特异性。
6) 结直肠癌血浆miRNA改变的综合分析：利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）对miRNA转录的改变进行了整合分析。并通过网络和通路重叠，根据显著性评分对改变的miRA进行分类。利用NCBI基因数据库搜索字符串miRNA和耐药将改变后的血浆miRNA模式整合到耐药机制中。
7) 差异表达分析、功能富集分析：使用fold-change (FC)进行差异表达分析。
三．研究的主要内容及结果
1. TCGA数据及血浆样本芯片数据miRNA差异表达研究
作者首先对TCGA数据及芯片数据进行差异表达分析，识别出组织及血浆特异的差异miRNA，作者使用fold-change (FC)分析TCGA数据中结肠癌及对照样本，识别出276 个差异 miRNAs 。对TCGA数据中直肠肿瘤组织与正常组织的分析识别出了239个改变的miRNAs。对38份未接受化疗的结直肠癌患者的血浆样本和16份对照样本进行微阵列芯片测序，使用FC对结肠癌血浆样本与健康对照的差异表达分析，识别出了255个差异miRNAs，而在直肠癌的血浆样本和健康对照组中，观察到270个差异的miRNA。结肠直肠血浆样本与健康对照的全局分析展示出359个改变miRNA。差异miRNA的热图如图1A-C所示，下调miRNA的韦恩图如图1D所示，图1E展示了其涉及到的生物学过程，图1F中给出了过表达组的相似信息，图1G中展示了其涉及的生物过程分类。TGCA数据与血浆数据的交集显示在图2中，展示了组织与血浆之间共同的miRNA特征(图2A，B结肠癌，图2C，D直肠癌，图2E，F结直肠癌)。

图1 差异表达miRNA概述

图2 TCGA和血浆数据中miRNA表达谱模式
2. 化疗对血浆miRNA的影响
在这一部分作者将研究目光放在化疗对血浆miRNA的影响上，对未治疗的结直肠癌患者和化疗的结直肠癌患者血浆中microRNAs进行微阵列分析，发现14个下调的miRNA和49个上调的miRNA，其热图如图3A所示。作者对接受化疗的直肠癌患者与未接受化疗的患者进行的类似分析识别出10个miRNAs下调，40个miRNAs上调，其维恩图如图3B,C所示。接着作者研究这些miRNA涉及到的生物学过程，5种最常见的下调miRNA被证明靶向图3D中涉及509个基因的关键细胞过程，而图3E显示了mRNA-miRNA网络，靶向的基因涉及癌症通路、Wnt信号通路等生物学过程。共出现的25种过表达miRNA参与的关键细胞过程如图3F所示，图3G显示了参与p53信号转导的miRNA网络。

图3 化疗影响的miRNA表达谱和通路分析
3. RT-PCR组织和血浆验证
在这一部分作者执行RT-PCA对研究的miRNA进行验证，为了验证芯片数据，作者选择四个miRNA（miR-1228-3p,miR-642b-3p, miR-195-5p 及miR-4741）作为panel，结果发现miR-642b-3p、miR-195-5p和miR-4741在肿瘤组织中的表达水平与芯片实验结果一致，如图4A所示，作者将数据整合为Circos图(图4B)。miR-1228-3p是结肠、直肠和结肠直肠血浆微阵列分析中上调最多的转录本，这一事实也在血浆水平上得到了qRT-PCR证实。然而，与TCGA结果一致，其在组织中表达水平被下调(图4C)，图4D展示了miR1228-5p的直接靶点。图5A是基于TCGA数据的miR-195、miR-1228、miR-4741和miR642的热图，图5B中展示了这些miRNA所调控的重要通路。

图4 组织和血浆qRT-PCR数据验证

图5 耐药性相关的结肠、直肠和结直肠癌的miRNA特征
4. 应用IPA评估血浆miRNA作为结直肠癌的原始信号分子
在这一部分作者应用IPA来可视化大肠癌血浆和健康对照组之间差异表达的miRNA的潜在相互作用网络。IPA是一个能够对改变的miRNA和最相关的基因之间的相互联系进行综合鉴定的生物信息学工具。IPA分析用于根据相关网络对miRNA转录本进行分类，结果在表1中进行了总结，图6显示了主要的变化网络。

表1 与血浆miRNA模式改变最相关的网络

图6 利用IPA生成的miRNA网络
5. 血浆miRNA作为耐药机制的调节因子
在文章的最后一部分，作者对血浆miRNA与耐药机制进行了研究，作者研究发现，在文献中发现了更多的差异miRNA，它们是化疗耐药的关键靶基因和治疗反应的生物标志物。作者将这些耐药相关的NCBI miRNA列表与改变的miRNA模式取交集，维恩图如图7A，可以看出作者识别了20个涉及结直肠癌和结肠癌耐药的转录本，以及3个针对直肠癌的转录本。图7B展示了使用DIANA-miRPath v3.0生成的20个共出现的miRNAs的热图，并显示了涉及的主要生物学过程。而在结肠直肠癌化疗与未化疗的分析中，作者识别了一个由7个miRNAs组成的小组作为耐药机制的调节因子(图8A)，图8B展示了这些miRNA涉及到的生物学过程。共同miRNA的miRnet网络展示了与癌症细胞循环调控、凋亡等通路相关的重要靶基因。

图7 血浆miRNA是耐药的关键调节因子

图8 血浆过表达的miRNA是耐药的关键调节因子

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，文章中作者对TCGA结直肠癌组织数据及血浆芯片数据进行分析，研究结直肠癌血浆及组织中的miRNA，识别出一些血浆特异性miRNA。文章主要使用了差异分析、功能富集等十分基础的生物信息学方法，但是将目光放在了血浆中的miRNA上，对其进行了多方面研究，研究的角度值得我们学习。

转自生信人

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