全长扩增子研究揭示盐渍土壤豆科植物根瘤微生物差异

The Root Nodule Microbiome of Cultivated and Wild Halophytic Legumes Showed Similar Diversity but Distinct Community Structure in Yellow River Delta Saline Soils4.167Microorganisms . 2020 Feb 3;8(2):207. doi: 10.3390/microorganisms8020207.

Abstract

Symbiotic associations between leguminous plants and their nodule microbiome play a key role in sustainable agriculture by facilitating the fixation of atmospheric nitrogen and enhancing plant stress resistance. This study aimed to decipher the root nodule microbiome of two halophytic legumes, Sesbania cannabina and Glycine soja, which grow in saline soils of the Yellow River Delta, China, using PacBio's circular consensus sequencing for full-length bacterial 16S rRNA gene to obtain finer taxonomic information. The cultivated legume Glycine max was used for comparison. We identified 18 bacterial genera and 55 species in nodule samples, which mainly classified to Proteobacteria, and rhizobial genus Ensifer was the predominant group. The three legumes showed similarity in operational taxonomic unit (OTU) diversity but distinction in OTU richness, indicating that they harbor similar bacterial species with different relative contents. The results of principal coordinates analysis and ANOSIM tests indicated that G. soja and G. max have similar nodule bacterial communities, and these communities differ from that of S. cannabina. Wild legumes S. cannabina and G. soja both harbored a higher number of rhizobia, while G. max possessed more non-rhizobial bacteria. These differences could be associated with their adaptability to saline-alkali stress and revealed clues on the nodule endophytes with relative importance of culturable rhizobial symbionts.   

Keywords: 16S rDNA full-length amplicon sequencing; Glycine soja; Sesbania cannabina; halophytic legume; nodule microbiome.

研究表明，耐盐植物是改善盐碱土壤的一种新的有效方法，一年生豆科植物由于具有高生产力、耐盐能力和对寡营养环境适应的特点，被认为是沿海盐渍土壤改良的理想候选植物。微生物在介导宿主植物耐盐性产生中发挥着重要作用，然而根瘤微生物研究主要集中在可培养根瘤菌的生物学特性和遗传多样性上，研究者选择野生田菁(Sesbania cannabina)、野生大豆(Glycine soja)和栽培大豆(Glycine max)作为实验材料，结合全长16s rRNA技术，从物种水平探究并比较了栽培和野生豆科植物根瘤微生物群，研究成果在2020年2月3日，以“The Root Nodule Microbiome of Cultivated and Wild Halophytic Legumes Showed Similar Diversity but Distinct Community Structure in Yellow River Delta Saline Soils”为题发表在国际知名期刊《Microorganisms》上。

实验设计

1. 田间试验

以中度盐渍土为实验对象，盐分含量为0.43%，同时测定土壤pH、有机碳、有机磷和有效氮等理化性质。分别以150、50和100kg/hm播种田菁、野生大豆和栽培大豆，于88d后收集根瘤；

以提取的根瘤DNA为模板，选择27F-1492R引物，利用Pacbio RS11平台进行测序；

研究结果

1. 自然条件结瘤能力差异

在盐胁迫条件下，田菁和野生大豆生长状态良好，栽培大豆生长受到抑制（图1）。三种豆科植物的根瘤性状和大小也表现出一定差异（表1），野生豆类的固氮酶活性显著高于栽培大豆（P<0.05）。

表1. 盐胁迫条件下三种豆科植物根瘤的形态特征和固氮酶活性

2. 微生物群落多样性

通过Pacbio平台测序共获得15134条高质量序列，序列比对结果表明，大多数序列能够鉴定到物种水平。分析结果显示细菌多样性无显着差异，但在细菌丰富度方面有明显区别（表2），qPCR结果展示三种豆科植物根瘤细菌数量存在差异（图2），说明三种豆科植物的根瘤虽然具有相似的细菌种类，但是在相对含量方面存在差异。

通过与Silva 128数据库比对，确定OTU代表的序列均属于变形菌门和拟杆菌门，其中变形菌门是所有根瘤样品中的核心菌门，占总序列的97.64%（图3a）。属水平分类结果显示，根瘤菌中包含以Ensifer属为优势菌属的共18个属（图3b）。在种水平上，共鉴定到55个种，其中31种为根瘤菌，24种为非根瘤菌。根瘤菌中优势菌仍然是以Ensifer americanum 、Ensifer alkalisoli YIC4027和Ensifer sp.为代表的的菌株，非根瘤菌中的优势菌主要包括Enterobacter cloacae、Stenotrophomonas sp. CanR-75和Stenotrophomonas maltophilia。

表2. 不同样本OTU丰富度和多样性指数统计

图2.qPCR确定细菌16s rRNA丰度。Sesbania cannabina(Sc), Glycine soja (Gs), Glycine max(Gm)

图3. 根瘤样本中门水平(a)和属水平(b)细菌相对丰度

3. 不同样本组中细菌的比较分析

研究分析了三种豆科植物中共有和特有的OTU数量（图4），发现三种豆类特有的OTU数量分别为6、24和13，说明三种豆类的根瘤微生物种类相似。PCoA结果表明，不同根瘤样本相关的OTU水平细菌群落存在差异，大豆样本聚类更紧密，并且与田菁样本有明显分离（图5）。

图4. 不同根瘤样本OTU的韦恩图(a)与花瓣图(b)

图5. 内生根瘤菌群落在OTU水平上的主坐标分析

研究基于全长16s rRNA测序，揭示了豆科植物根瘤样本微生物能够被分类为18个属55个种，除根瘤菌外还包括大量的根瘤内生菌，表明植物可以募集不同的根瘤内生菌以适应盐渍土壤，拓展了关于豆类根瘤内生细菌的多样性和丰富度的认识。研究结果表明，盐渍土壤中栽培和野生盐生植物豆科根瘤微生物组的多样性相似，但群落结构表现出差异，这些差异可能与盐碱胁迫的适应性有关，说明黄河三角洲的盐渍土可能对豆科根瘤菌菌群和结构产生重大影响。

拓展

在文章最后，作者提出了利用这些细菌促进盐渍土壤农作物生长的可能方案：（1）破译盐生豆科植物和栽培豆科植物的根瘤菌群以鉴定核心菌群；（2）根据核心菌群从盐生豆科植物中分离根瘤菌菌株；（3）筛选能缓解栽培豆科植物盐胁迫的高效菌剂菌株（图6）。

图6. 利用与盐生豆类相关的根瘤微生物的概念性策略