A Single-Cell Landscape of High-Grade Serous Ovarian Cancer36.13Nat Med . 2020 Jun 22. doi: 10.1038/s41591-020-0926-0. Online ahead of print.
Abstract
Malignant abdominal fluid (ascites) frequently develops in women with advanced high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) and is associated with drug resistance and a poor prognosis1. To comprehensively characterize the HGSOC ascites ecosystem, we used single-cell RNA sequencing to profile ~11,000 cells from 22 ascites specimens from 11 patients with HGSOC. We found significant inter-patient variability in the composition and functional programs of ascites cells, including immunomodulatory fibroblast sub-populations and dichotomous macrophage populations. We found that the previously described immunoreactive and mesenchymal subtypes of HGSOC, which have prognostic implications, reflect the abundance of immune infiltrates and fibroblasts rather than distinct subsets of malignant cells2. Malignant cell variability was partly explained by heterogeneous copy number alteration patterns or expression of a stemness program. Malignant cells shared expression of inflammatory programs that were largely recapitulated in single-cell RNA sequencing of ~35,000 cells from additionally collected samples, including three ascites, two primary HGSOC tumors and three patient ascites-derived xenograft models. Inhibition of the JAK/STAT pathway, which was expressed in both malignant cells and cancer-associated fibroblasts, had potent anti-tumor activity in primary short-term cultures and patient-derived xenograft models. Our work contributes to resolving the HSGOC landscape3-5 and provides a resource for the development of novel therapeutic approaches.
卵巢癌细胞和相关的非恶性肿瘤细胞的肿瘤内异质性是驱动治疗耐药性的重要因素，对其仍知之甚少，对肿瘤患者腹水样品的单细胞转录组测序可以解析多种癌症，免疫和基质细胞及其表达谱相互作用。（1）尽管最近复发性卵巢癌在治疗方面具有一定进展，但仍无法治愈，预后不良，中位生存期仅为1年；（2）晚期浆液性卵巢癌（HGSOC）的基因组分析特征：TP53突变、同源重组DNA修复的缺陷、广泛的拷贝数畸变；（3）在诊断时，三分之一的卵巢癌患者存在腹水（由多种细胞类型组成），并且经常发生在对化疗有抗药性的患者中。sample：包括3个样本队列，cohort 1 ：6位患者的8个腹水样本，cohort 2 ：6位患者的14个腹水样本，cohort 3：三个腹水样本和两个原发性肿瘤方法：Plate-based scRNA-seq：modifified Smart-seq2 Droplet-based scRNA-seq：10× Genomics首先研究人员使用cohort 1 腹水样本队列进行单细胞测序，共发现18个细胞亚群（图1b），包括上皮细胞（由EPCAM标记，5个clusters），巨噬细胞（由 CD14, AIF1, CSF1R 和 CD163标记，4个clusters ），肿瘤相关成纤维细胞（由PDPN, DCN 和THY1标记，4个clusters ），树突状细胞（由CD1C, CD1E, CCR7 和 CD83标记，2个clusters ），B细胞（CD19和CD79A/B ），T细胞（CD2和CD3D/E/G ）以及红细胞（GATA1和血红蛋白编码基因）。图1c展现了不同患者样本的细胞比例构成， 在癌细胞之间，作者发现有明显的患者间异质性（图1b-d），并证明与以前患者的治疗史无关。在肿瘤相关成纤维细胞中，作者发现不同的细胞状态，例如与cluster6,7相比，cluster8和9高表达补体因子（C1QA / B / C和CFB），趋化因子（CXCL1 /2/10/12）和细胞因子（IL6和IL10）。然后作者探究了巨噬细胞的异质性，在cluster 10中可以将细胞分为两个亚群，Group 1高表达MHCII类相关基因,IFNGR1, CD1D, CD36 and CD52 ，Group 2高表达补体因子，组织蛋白酶编辑基因和APO基因。此外，Group 1高表达M1巨噬细胞的标志物（IFNGR1，CD36，DDX5和MNDA）和M2分化的抑制因子（C3AR1），Group 2高表达M2巨噬细胞相关标志物。图1 droplet-based scRNA-seq 样本单细胞分群及比例分析
（2）识别HGSOC患者间和患者内恶性细胞的异质性作者结合FACS，对样本cohort 2进行单细胞全长转录组测序，并发现一共可以分为8个clusters（图2a，b），包括上皮细胞，CAFs及巨噬细胞。与巨噬细胞和CAF相比，恶性肿瘤细胞根据患者的来源进行聚类（图2a，b），突出了个体之间的差异。接下来，作者想要探究患者之间恶性细胞之间的变异性是否和TCGA中发现的亚型相一致：分化型，增生性，间质性和免疫反应性。如图2d所示，在所有的肿瘤细胞中均表达高度分化的标志，只有一个cluster高表达增殖的标志，而间充质和免疫反应性在肿瘤细胞中基本不表达，但分别由CAF和巨噬细胞cluster中高度表达。因此，间充质和免疫反应性亚型可以分别代表CAF和巨噬细胞的肿瘤内丰度。因此，基于bulk seq的亚型分类可能主要反映了肿瘤生态系统的组成，而不是癌细胞衍生的HGSOC亚型。
图2 使用 FACS和plate-based scRNA-seq对腹水样本的单细胞分群作者使用非负矩阵分解（NMF）在整个恶性细胞中鉴定出35个模块，这些模块具有一致的基因表达变化（图3a–c）。模块中包含许多功能，包括细胞周期（例如CCNA2，CCNB2和AURKB），炎症（例如IL6，IL32，TNF和IFI6）以及压力或激活（例如HSPA5–7，ATF4，JUN和DDIT3）。与先前的工作一致，作者发现了恶性和非恶性细胞中个体内和个体间异质性，有助于塑造HGSOC生态系统。为了确定患者之间相同的癌细胞程序，作者比较了不同患者之间的模块（图3d）。细胞周期模块有很强的重叠，表明在所有标本中都存在增殖的细胞亚群。此外，患者之间均具有三个以免疫或炎症相关基因为主导的程序（图3d，e）：炎性细胞因子模块（例如，IL6，TNF，IL8和IL32），MHC II类抗原呈递模块（例如CD74和HLA-DRA）和干扰素响应模块（例如IFI6，IFIT1和ISG15）。
图3 瘤内不同模块的基因表达差异
（4）炎性癌细胞程序可以通过腹水微环境诱导或反映癌细胞的内源性为了评估不同的可能性，作者通过对三个建立的PDX模型（DF20，DF68和DF101）进行单细胞测序（图S7），发现PDX与患者癌细胞之间存在强烈的相关性（Pearson's r = 0.819）。9个PDX模块与患者样品中的模块相似，包括3个细胞周期（PDX模块1-3）和3个干扰素反应程序（PDX模块6-8）（图S7f），突出患者与PDX模型异质性模式之间的相似性（除了细胞周期外）。在PDX模型中未检测到患者中发现的其他两个与炎症相关的程序（细胞因子和抗原呈递模块）（图S7g），这表明它们在癌细胞中的表达可能取决于完整的免疫系统。于是作者认为以上结论均与JAK / STAT途径相关。首先，癌细胞亚群高表达可能位于JAK / STAT通路下游的三个免疫相关程序。其次，腹水微环境中的细胞（例如CAF），高表达激活JAK / STAT途径的分泌性配体相关基因（例如IL6和CXCL12）。第三，对大量信号基因的分析突显了在恶性和非恶性细胞中，JAK / STAT通路成分的表达特别高且普遍存在（图3g，h）。
图S7 恶性细胞中的某些程序在患者腹水和PDX之间复发
（5）为了确定JAK / STAT抑制的影响，作者使用了针对该通路不同节点的15种化合物以及HGSOC细胞系OVCAR4中的铂类化学疗法进行了药物筛选，并鉴定出JSI-124可以作为细胞活力的有效抑制剂（图4a）。JSI-124在三种不同的患者来源的细胞培养模型和其他HGSOC细胞系中显示出纳摩尔剂量的抗肿瘤活性，而其他常用于治疗HGSOC患者的药物几乎没有活性（图4b，c）。在PDX模型中，JSI-124治疗的早期（腹膜内或皮下注射肿瘤细胞后7 d）消除了恶性腹水的发生以及肿瘤分别生长（图4g，i），并且可以显着降低了疾病负担（图4h，j）。总之，这些结果表明，通过作用于恶性细胞，非恶性细胞或两者，JAK / STAT抑制剂可能是HGSOC患者的有效治疗选择。
图4 JAK / STAT抑制可降低HGSOC模型的生存力，球体形成和侵袭能力
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