肝癌中19号染色体的miRNA簇与肿瘤负荷和病人预后的联系

The Chromosome 19 microRNA Cluster, Regulated by Promoter Hypomethylation, Is Associated With Tumour Burden and Poor Prognosis in Patients With Hepatocellular Carcinoma5.546J Cell Physiol . 2020 Sep;235(9):6103-6112. doi: 10.1002/jcp.29538. Epub 2020 Jan 24.

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is still one of the major malignant tumours with poor prognosis. The chromosome 19 microRNA cluster (C19MC) is the largest miRNA cluster, and its functions and regulatory mechanisms remain unclear in HCC. We extracted data from 373 HCC samples and 50 non-tumour samples from The Cancer Genome Atlas database. The differential expression levels and methylation levels of C19MC as well as the correlation between them were analysed. We evaluated the correlation between the expression levels of C19MC and the clinical features. We further performed prognostic analysis for C19MC and analysed the bioinformatic function. C19MC had upregulated expression levels and promoter hypomethylation in HCC. A significant negative correlation between the high expression and low methylation level of C19MC was obtained. In addition, the positive correlation between the expression levels of C19MC and the tumour grade, tumour stage and T-stage is shown. Three miRNAs (mir-512-1, mir-516a-1, mir-519a-2) were negatively associated with overall survival on the basis of the Kaplan-Meier analysis and the 3-miRNA signature was significant for the prognostic assessment of HCC. A bioinformatic enrichment analysis suggested that the target genes of the 3 miRNAs may be associated with mitogen-activated protein kinase pathways related to cancer invasion. In summary, our novel study demonstrated that the hypomethylation of promoters upregulates the expression levels of C19MC and that C19MC may represent a potential new candidate for the diagnosis and therapy of HCC.  

Keywords: C19MC; TCGA; hepatocellular carcinoma; methylation.

miRNA簇通常指的是一类miRNA基因在染色体上成簇排列形成的基因群。肝细胞癌（HCC）是预后不良的主要恶性肿瘤之一。19号染色体（C19MC）是最大的miRNA簇，C19MC在HCC中的功能和调控机制仍不清楚。作者从TCGA数据库中下载373个HCC样本和50个正常样本。分析了C19MC的表达水平和甲基化水平以及它们之间的相关性。进一步评估了C19MC的表达水平与临床特征之间的相关性。发现C19MC在HCC中表达水平上调，且miRNA的启动子低甲基化。C19MC的表达和甲基化水平之间有显著的负相关性。此外，C19MC的表达水平与T stage等临床特征相关。通过Kaplan-Meier分析，发现3个miRNA（mir-512-1、mir-516a-1、mir-519a-2）与总生存相关。miRNA靶基因的富集分析表明，3个miRNAs的靶基因可能与癌症侵袭相关。综上，该研究表明启动子的低甲基化能上调C19MC的表达水平，C19MC可能作为HCC诊断和治疗的潜在候选标志物。


材料方法
1. 数据获取和分析
373例HCC和50例正常样本的miRNA-Seq、DNA甲基化和临床数据。使用“edgR”进行差异表达分析。筛选log2FC > 1（此处不理解为何仅仅筛选上调基因）和FDR < 0.05认为是差异表达基因。CpG位点的甲基化水平为β值。对一个miRNA启动子存在多个CpG位点的情况下，计算CpG位点平均值作为miRNA的甲基化水平。对miRNA表达水平和甲基化水平计算spearman相关性。
2.   C19MC的生存分析
根据C19MC表达水平，对样本绘制KM曲线进行生存分析，评价C19MC表达与OS的关系。将HCC的C19MC表达中位数作为阈值分为两类。生存分析是采用R“Survival”包进行单因素cox回归分析。筛选p < 0.05的miRNA来建立miRNA预后特征。并针对预测模型绘制ROC曲线。
3. miRNAs的目标预测和功能分析
利用TargetScan、miRWalk和miRDB筛选miRNAs靶基因。并使用“STRING”数据库分析和可视化靶基因之间的PPI。利用“DAVID”在线工具进行基因功能富集分析。
结果
1. C19MC在肝癌中的高表达水平
从TGCA（文章笔误，应为TCGA）下载373例HCC样本和50个正常对照。使用“edgeR”包筛选差异表达的miRNA。发现C19MC中的所有46个miRNA均表现出上调状态（图1A）。表明与正常组织相比，C19MC在HCC样品中出现高表达状态。并绘制了miRNA的表达热图（图1B）。


图1 C19MC miRNA在HCC高表达
2. 启动子低甲基化导致C19MC上调
为了研究C19MC miRNA上调的机制，计算C19MC启动子的甲基化水平和表达水平之间的相关性。使用TGCA（文章笔误，应为TCGA）的甲基化数据。发现HCC样本中的甲基化水平相比正常样本低（图2A）。为了进一步确定每种miRNA差异表达的影响，这表明所有C19MC启动子的甲基化水平在HCC样品中均显著降低（图2B），其实和图2A感觉表达同一个意思，换不同的图进行展示。因此作者推测C19MC miRNA的高表达水平可能与启动子低甲基化有关。接着计算C19MC miRNA表达水平与甲基化水平的Spearman相关系数来评估相关性。发现了C19MC的表达与甲基化水平之间的显著负相关（图S2）。

图2：启动子低甲基化导致C19MC上调


图S2. miRNA表达与启动子甲基化相关性
3. C19MC的高表达水平与组织病理学特征和存活率相关
进一步分析miRNA的表达与HCC患者的组织病理学特征和生存率的关联。得到348个HCC样本（缺乏临床信息排除25个）用于分析C19MC miRNA表达水平与临床特征的关系。结果表明，T stage高的HCC病人C19MC miRNA水平较高（图3）。

图3 C19MC miRNA表达与HCC的T stage相关。
利用绘制KM曲线，发现在所有46种miRNA中，有3种（mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2）与OS呈负相关（图4A）。利用单因素cox分析发现mir-512-1和mir-516a-1以及T stage与OS相关（图4B）。T stage预后模型的AUC为0.728，与3个miRNA标志一起，AUC值升至0.76。表明3个miRNA对预测HCC患者的OS具有一定的意义（图4C）。

图4 C19MC作为预后标记预测HCC生存
4. miRNA靶基因预测和功能分析
使用TargetScan，miRWalk和miRDB预测3个miRNA的靶基因，使用“Venny”进行可视化（图5A）。提取3个miRNA的靶基因的交集。结果发现3个miRNA有196个共同靶基因（图5B）。对196个靶基因通过STRING数据库识别PPI，设置得分 > 0.9作为阈值构建的PPI网络（图5C）。

图5. 三个miRNA的靶基因预测和PPI分析
5. 目标基因的GO富集和KEGG途径
对196个共同的靶基因进行GO分析（图6A）。KEGG通路富集分析结果如表1所示。进一步分析了MAPK通路中的6个靶基因的表达，发现HCC中的三个基因MAP3K2，MAP2K4和MAPK10的表达下调（图6B）。这三个关键靶基因位于c-Jun N-terminal kinase (JNK)轴（图6C）。结果表明三种miRNA可能通过抑制JNK轴的功能来促进肝癌的侵袭，从而影响肝癌的预后。
图6. 靶基因功能分析
表1. KEGG富集分析

总而言之呢，该研究使用TCGA的HCC数据来发现C19MC在HCC中呈现出上调，且miRNA是受到启动子低甲基化调控。生存分析发现C19MC的表达水平与组织病理学特征相关。进一步功能分析发现miRNA可能通过MAPK pathway促进HCC的肿瘤侵袭。

转自生信人

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