高效宏基因组ARGs分析方法简介

ARGs数据库集成：

1：利用CARD及ARDB数据库集成ARGs数据库（包含CARD的2513条蛋白序列及ARDB的7828条序列）

2：去除非ARG的序列

3：去除冗余序列（保留100%同源的序列，此步骤之后仅保留了4401条序列）

4：去除SNP相关的序列

5：获得SARG数据库

6：对SARG数据库进行类型-亚型-参考序列的划分

在数据分析上，研究者开发出了ARGs-OAP流程，有两部分构成（如下图）：

1：使用本地计算机对潜在ARGs序列进行预筛选，以减少在线注释的序列文件大小。

2：利用在线平台进行ARG序列注释和分类。

基于这样的流程构建出的SARGs数据库，其效用如何？利用其ARGs-oap流程开展的抗性基因注释，效果又如何呢？

首先，对研究构建出的SARG数据库进行评估：在对所有序列进行分类和验证后，SARG数据库共含有23个大的ARG类型，共计1227个ARG亚型和4246条参考序列，在ARG亚型中有超过72%的亚型（887种亚型）属于β-内酰胺抗性（共计1497条序列），之后是广谱抗性（935条序列）和氨基糖苷类抗性（275条序列）。数据库统计情况如下图：

接着，采用模拟数据集评价ARGs-oap流程进行ARG注释的情况：研究评价了数据库完整性、BLASTX使用的特征值(即E值、标识和命中长度)和序列长度对ARGs注释的影响：

利用两个模拟数据集评价数据库完整性的影响——数据集1含有一些ARG集成数据库的序列和一些非arg序列，数据集2除了1的部分外还增加了Swiss-Port中不包含在ARG集成库的ARG序列——集成ARG库对数据集1而言是完整的，对数据集2而言不完整。结果表明，当数据集含有新的ARG序列时，如果识别特征值在60%以上，MCC值（马修斯相关系数）显著降低（下图a,b）；在这个临界点，灵敏度也大大下降（图d,e），但是数据库的不完整性对注释的精确度影响不大（图g,h）。

E值等对ARGs注释的影响也进行了评估：结果表明，MCC值和精密度随E值的降低而增加，但灵敏度变化不大（下图）。

在E值为1e-7，特征临界值60%下评价序列长度对ARG注释的影响：结果显示，当命中长度小于序列长度的85%时，对灵敏度和MCC值的影响很小但当命中长度从85%增加到100%时，灵敏度和MCC值急剧下降，表明如果选择一个更严格的命中长度，研究将丢失更多的ARGs样序列信息。此外，考虑到读长造成的序列长度差异，进一步评估发现，长读取会有较高的MCC及灵敏度——MCC值，灵敏度及精确度在type水平比亚型水平更高。

总的来说，较长的读取长度、较高的同一性和较低的E值降低了干扰率，而较长的序列提高了注释的准确性，引用数据库的完整性对注释结果有显著的影响。整合上述结果，E值为1e-7，识别率为60%是在当前版本的SARG库中进行ARG注释，考虑MCC值、灵敏度和精密度三方面均衡良好的最适宜条件。

利用宏基因组数进行ARGs注释的ARGs-OAP:如前所述，第一步是在用户的本地计算机上使用UBLAST从元组数据集中预先筛选潜在的args序列，然后进行第二步的序列注释,利用在线分析平台上传潜在ARGS序列后进行分类注释。该流程支持多样本分析，并可生成ARG丰度表，该丰度表会经过宏基因组数据中ARG参考序列长度，16s rRNA基因及细胞数量统计的标准化矫正，结果包括：1.所有上传样本的ARGs丰度表（该信息经过与其他参考宏组学数据比较，在类型、亚型水平上经过16S rRNA基因数的归一化处理）；2.经细胞数矫正归一化的ARGs丰度；3.上传样本数据与参考数据库在亚型水平的PCoA分析结果。

最后的最后，ARGs-oap流程的耗时也进行了评估，利用三种不同类型宏基因组数据（均为100bp长度的序列10M reads）进行流程运算，进行潜在ARGs序列及16s rRNA基因预筛的耗时在105-124min之间（64位UBlast,本地计算机单线程处理，每个数据集1000万次读取）。通过此研究提供的脚本，将三个样本数据集合并为一个大数据集，这样序列数相比于其他原始数据集有了显著的降低。