Cancer Cell：可变剪接算法助力揭示胶质母细胞瘤治疗后发生恶化的幕后推手

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，具有高侵袭性、生长迅速、预后差等特点，是神经外科治疗中最棘手的难治性肿瘤之一。临床上将GBM分为三种亚型：促神经元亚型（proneural，PN），经典亚型（classical）和间充质亚型（mesenchymal，MES）[1-3]。一系列临床数据证实，接受治疗后的GBM存活细胞会从较低侵袭性的PN表型向更高侵袭性且产生治疗抗性的MES表型转化[2,4]，从而增大了复发风险和后续治疗难度。

   　被寄予生存希望的临床治疗反而导致了肿瘤的进一步恶化，使得GBM的治疗陷入了进退两难的境地。那到底是什么原因导致了这种现象的发生？肿瘤的恶化真的是由治疗造成的吗？背后的分子机制又是怎样？

   　下面这篇来自伯明翰阿拉巴马大学（UAB）的神经外科教授Nakano博士的研究，也许可以为我们找到问题的答案，揪出肿瘤恶化的幕后推手。

       2018年7月份，一篇来自美国、俄罗斯、韩国和中国的联合研究小组-Nakano团队的研究发现，发生凋亡的GBM细胞通过其诱导和释放的细胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles，apoEVs）向邻近的存活肿瘤细胞发送信号，从而促进后者的增殖、侵袭性、运动性以及对放射或化学疗法的抗性。接着，研究者鉴定出一个代表性剪接因子—RBM11，该因子在肿瘤治疗后出现表达上调，并且散布在细胞凋亡后分泌的细胞外囊泡中。这些囊泡一旦进入受体细胞，剪接因子RBM11将会改变细胞内MDM4和细胞周期蛋白D1的剪接方式，导致更具致癌性的细胞亚型发生表达。因此，该机制成为治疗原发性脑癌胶质母细胞瘤的新疗法的可能靶标，并且可适用于其他癌症类型。

　　该文章以“Apoptotic Cell-Derived Extracellular Vesicles Promote Malignancy of Glioblastoma Via Intercellular Transfer of Splicing Factors”为题发表于国际顶级期刊Cancer Cell（IF22.8）[5]，并在可变剪接的研究部分对自主研发的可变剪接算法ASD进行了引用。

1、apoEVs促进受体细胞向侵袭性表型转化

     研究者构建了小鼠的GBM临床模型，并通过大量体内外生物学实验证实，细胞凋亡导致GBM细胞分泌出数量更多且体积更大的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），存活细胞可以有效捕获EV。存活细胞在EV中所包含的某种分泌因子的诱导下，向MES表型转化，从而获得更强的增殖能力、侵袭力和治疗抗性。

Figure 1. 是否暴露于apoEVs中的小鼠生存曲线

Figure 2. apoEVs促使PN GBM细胞向MES GBM细胞转化

2、apoEVs中富含剪接体蛋白和U snRNAs

为了解析apoEVs的分子机制，研究者利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS），分别对未经处理的和受到致死辐射的肿瘤中EVs中的蛋白质种类进行了鉴定。结果显示，在两组样本中存在显著差异的主要有蛋白酶体和剪接体蛋白。剪接体蛋白通常与尿嘧啶富集的非编码小RNA（U snRNAs）结合形成复合物，qRT-PCR显示apoEVs中富含所有类型的剪接体U snRNAs复合物。

Figure 3. apoEVs中富含剪接体蛋白和U snRNAs

3、剪接体蛋白的传递依赖细胞凋亡蛋白酶

　细胞凋亡蛋白酶的活化促使凋亡GBM细胞将剪接体蛋白从细胞核中释放出来，然后由apoEVs封装进入囊泡，继而排出细胞，这可能是剪接体发生细胞间传递的可能机制之一。

Figure 4. 剪接体蛋白的传递依赖细胞凋亡蛋白酶

4、apoEVs诱导受体细胞中发生类似MES的剪接形式改变

　　发现apoEVs中的剪接体成分之后，研究者开始怀疑受体细胞中的表型改变是否是由RNA的可变剪接造成的？

     为了验证这一猜想，研究者分别对未经处理的MES GBM细胞和PN GBM细胞，加入apoEVs的PN GBM细胞和加入空白对照介质的PN GBM细胞，以及加入apoEVs后又将其过滤掉的PN GBM细胞，进行了双端100bp的转录组测序（RNA-Seq）。测序结果显示apoEVs对mRNA的剪切模式产生了重要影响。

     对不同分组间的可变剪接事件（alternative splicing events，ASEs）进行维恩分析，超过30%的ASEs受到apoEVs的影响，而这些ASEs恰恰与MES GBM的治疗抗性相关。GO分析显示，apoEVs诱导的ASE会对调控DNA损伤修复和压力回应的基因产生影响。

Figure 5. （A-B）apoEVs诱导的ASE会对调控DNA损伤修复和压力回应的基因产生影响

　　为了检测apoEVs对受体细胞基因表达的影响，研究者将加入apoEVs的GBM157细胞培养4天之后进行了RNA-Seq，结果显示apoEVs的加入使得PN表型的marker基因表达下调，而MES表型的marker基因表达上调。

Figure 6. RBM11对RNA剪接的调控与细胞周期和细胞死亡有关

　　综上，该研究揭示了基于apoEVs介导的剪接体蛋白转移的癌细胞通讯机制。这种机制很可能适用于GBM以外的癌症类型。 在临床应用中，该研究数据可以为RNA剪接事件或特异性剪接因子的分子靶标提供论据，以减轻GBM治疗后发生恶性转化的可能。

可变剪接算法

　　可变剪接一直是疾病分子机制研究的热点之一，Nakano团队的研究则再次使其成为研究者们视线的焦点。2014年自主研发了选择性剪接分析软件（ASD，Alternative Splicing Detector，网址：http://www.novelbio.com/asd/ASD.html），文章发表于国际期刊Nucleic Acids Research（IF=10.162）[6]。