ATAC-seq送样步骤

动物细胞送样标准操作规程

实验步骤：

1：交联环境：交联过程操作需要在超净工作台中进行（准备工作）。

2：样品类型：动物细胞（即悬浮细胞和贴壁细胞），需在新鲜培养的状态下进行甲醛交联。

3：样本需要量：至少5万个细胞能够满足制备一个标准的ATAC-seq文库。如此根据所需文库数目即可计算出样本总需求量，建议培养5*10⁵个细胞用于固定，以保证实验的可重复性。由于细胞数量会影响ATAC-seq文库的复杂度，因此需要在细胞甲醛交联前，务必对细胞进行计数。

4：动物细胞甲醛交联

4.1贴壁细胞甲醒交联

4.1.1：通过细胞计数板或电子细胞计数仪预估每个培养瓶/皿的细胞数量；

4.1.2：在超净工作台内用工具吸出细胞液，每个培养瓶加入10ml的新鲜无血清培养液（一般选用DMEM培养液）；

4.1.3：培养瓶中再加入0.38ml的37%甲醛（甲醒终浓度为1%），加入甲醛后迅速摇匀；

4.1.4：室温精确孵育10min，每1-2min轻柔摇匀培养品，可以使用垂直混匀仪缓慢摇匀；

4.1.5：培养瓶中再加入1ml的2.5M甘氨酸，培养液由粉红色转变为明黄色，轻柔混匀，终止交联。

4.1.6：室温孵育5min，每2min轻柔摇匀培养瓶一次，然后置于冰上至少15min 以彻底终止反应；

4.1.7：用细胞刮刮下培养瓶中细胞并转入15ml离心管中；

4.1.2：将细胞混匀精确计数，然后严格按每管5*10⁴的数量分装细胞；

4.1.9：4℃离心机1000g离心10min，缓慢弃掉上清，加入3ml PBS重悬细胞，转移细胞至1.5ml离心管中；

4.1.10：4℃离心机1000g离心10min，吸去上清，用移液器务必将上清液去除干净；

4.1.11：制备完成的细胞可以用液氮速冻并置于-80℃储存，干冰运输。

4.2悬浮细胞甲醛交联

4.2.1：通过细胞计数板或电子细胞计数仪预估每个培养瓶/皿的细胞数量；

4.2.2：将培养瓶中培养液及悬浮细胞全部转入15ml离心营，室温500g离心10 min收集悬浮的细胞，弃上清；

4.2.3：使用10ml新鲜的无血清培养液彻底重悬细胞，移液器吹打混匀以打散细胞团；

4.2.4：15ml离心管中加入0.38ml的37%甲醛溶液，进行染色体的交联反应（甲醒终浓度为1%），颠倒混匀数次：

4.2.5：室温精确孵育10min，每1-2min轻柔颠倒泪匀，可以使用垂直混匀仪缓慢摇匀；

4.2.6：15ml离心管中再加入1ml的2.5M甘氨酸，培养液由粉红色转变为明黄色，轻柔混匀，终止交联；

4.2.7：室温孵育5min，每2min轻柔摇匀离心管一次，然后置于冰上至少15min以彻底终止反应；

4.2.8：将细胞混匀精确计数，然后严格按每管5*10⁴的数量分装细胞；

4.2.9：4℃离心机1000g离心10min，缓慢弃掉上清，加入3ml PBS重悬细胞，转移细胞至1.5ml离心管中；

4.2.10：4℃离心机1000g离心10min，吸去上清，用移液器务必将上清液去除干净；

4.2.11：制备完成的细胞可以用液氮速冻并置于-80℃储存，干冰运输。