DNA-蛋白质互作研究新方法——CUT&Tag

DNA与蛋白质之间的相互作用（DNA-Protein Interaction，DPI）是生物学领域中一个重要的研究方向，用于在全基因组范围中研究转录因子结合、组蛋白修饰和核小体的分布，有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构，是表观生物学的重要研究工具。

传统的ChIP-Seq将染色质免疫沉淀（ChIP）检测和测序技术相结合，能够真实反映结合在DNA序列上的靶蛋白，是目前鉴定转录因子及其他蛋白因子在全基因组范围内的DNA结合位点的标准实验技术。ChIP-Seq的基本实验流程包括：

（1）通过甲醛交联将细胞内与DNA结合的蛋白固定;

（2）裂解细胞分离基因组DNA，并超声打断;

（3）添加目标蛋白质特异的抗体与目标蛋白形成免疫复合体将DNA-蛋白复合物抓取下来;

（4）去交联，将DNA与蛋白解离，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本;

（5）将DNA片段补平，加A，加接头，构建文库，进行高通量测序。

1.jpg

ChIP-Seq流程图

(Dominic Schmidt et al., 2009)

    传统ChIP-Seq实验过程中甲醛交联时间和超声打断条件难以很好的控制，依赖于操作人员的经验和熟练的技术，DNA样本的处理和文库构建步骤繁琐，实验周期长，需要大量的细胞，实验重复性差，超声无差别打断使获得的数据信噪比低，这些技术上的困难限制了其进一步应用。
   2019年4月，美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication杂志发表了新的DPI研究方法——CUT&Tag技术。CUT&Tag技术利用同时具有切割和连接活性的Tn5转座酶对目标蛋白结合区域的DNA进行直接打断和标记，省略了免疫沉淀的步骤，从而大大简化了实验过程。

2.jpg

CUT&Tag原理

(Hatice S. Kaya-Okur et al., 2019)

CUT&Tag的基本实验流程包括：
（1）通过洋地黄皂苷通透细胞膜和核膜，使目标蛋白特异的抗体能够进入细胞核与目标蛋白结合，实现目标区域的精确定位；
（2）二抗进入细胞，与一抗结合，实现信号放大；
（3）利用Protein A/G-Tn5融合蛋白定位到抗体所在的目标区域，Tn5转座酶对其进行精确的切割和测序接头添加；
（4）细胞裂解，DNA片段回收，直接PCR扩增构建文库，进行高通量测序。
由于CUT&Tag技术仅对目标DNA片段进行打断，使得整个实验的信噪比大幅提高，转座酶在打断的同时给片段加上接头，后续建库不需要繁琐的补平加A加接头，简化了实验步骤，在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程。CUT&Tag实验重复性好，需要的细胞数量少至60个细胞。由于PCR之前的反应都是在细胞中原位进行，结合微孔板和组合标签技术，甚至可以实现高通量单细胞检测。

3.jpg

CUT&Tag结合微孔板和组合标签技术应用于高通量单细胞检测

(Shanshan Ai et al., 2019)

目前已推出CUT&Tag技术服务，如有需要请关注我们网站或者直接联系我们：（021）64160323，techsupport@argus-genomics.cn，

参考文献：

1. DominicSchmidt, Michael D. Wilson, Christiana Spyrou et al. ChIP-seq: usinghigh-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods, 2009,48(3): 240-248.

2. HaticeS. Kaya-Okur, Steven J. Wu, Christine A. Codomo et al. CUT&Tag forefficient epigenomic profiling of small samples and single cells. NatureCommunications, 2019, 10: 1-10.

3.Shanshan Ai, Haiqing Xiong, Chen C. Li et al. Profiling chromatin states usingsingle-cell itChIP-seq. Nature Cell Biology, 2019, 21: 1164-1172.

分享