中国有两个香菇种群：香菇和未挖掘的形态学物种，分别命名为A和B。已有研究发现这两个种群的核基因类型不同，根据其ITS2序列，香菇（ITS2-A）包含两个分支（ITS2-A1和ITS2-A2），未挖掘的形态学物种（ITS2-B）也包含两个分支（ITS2-B1和ITS2-B2）。
合作客户于《Scientific Reports》（IF=4.011）杂志发表最新关于中国两种香菇线粒体基因组类型研究。
由于ITS2序列位于核基因组中，那么具有不同ITS2类型的两个香菇种群否属于相同还是不同的线粒体基因组类型（mt）？本文选择了20种具有不同ITS2类型的香菇菌株进行重测序研究（下表）。具体研究内容如下：1）对L135菌株完整线粒体基因组进行测序，作为参考基因组；2）通过对19种ITS2类型不同的菌株线粒体基因组进行重新测序，研究了中国两个香菇种群的线粒体基因组类型；3）研究不同线粒体基因组类型之间的SNP和插入缺失多样性；4）对不同于L135类型的YAASM363菌株完整线粒体基因组进行测序，筛选合适的标记物以鉴定不同的线粒体基因组类型。
L135的线粒体基因组是一个环状DNA分子，大小为119,134 bp，GC含量为30.77%。基因组注释到15个保守的蛋白质编码基因，2个rRNA基因，26个tRNA基因，30个假定蛋白（10个在4个保守蛋白质编码基因的内含子中，4个在2个rRNA基因的内含子中以及16个在基因间区中）和3个其他功能组成（下图a）。基因功能如下表所示。YAASM363线粒体基因组的总长度和GC含量分别为115,116 bp和31.76%（下图b），包含15个保守的蛋白质编码基因，2个rRNA基因，26个tRNA基因，22个假定蛋白（10个在4个保守蛋白质编码基因的内含子中，3个在1个rRNA基因的内含子中和9个在基因间区中）和2个其他特征。 图1. L135（a）和YAASM363（b）的线粒体基因组图谱。蛋白编码基因（酒红色），rRNA基因（绿色），tRNA基因（瓶绿色），其他特征（灰色），内含子（虚线），假定蛋白（orf +数字）。
2、ITS2类型不同的20个菌株的线粒体基因组类型
研究中的20个菌株具有38个ITS序列，通过NJ法构建系统进化树发现，38个ITS2序列分为两个谱系：ITS2-A和ITS2-B。每个谱系又细分为2个分支（ITS2-A1和ITS2-A2，ITS2-B1和ITS2-B2）（下图a）。基于L135的线粒体基因组，对其余19个菌株进行了重测序，并组装了它们的线粒体基因组。与参考基因组比对，共鉴定出12,321个SNP和2,272个插入缺失。NJ树显示20个菌株的线粒体基因组属于两个不同的谱系mt-A和mt-B。mt-A细分为两个分支mt-A1和mt-A2（下图b）。主成分分析（PCA）（下图c）和种群结构分析（下图d）证明了NJ树的结果。其中3个菌株（YAASM298，YAAASM301和YAAASM2323）是mt-A和mt-B之间的重组线粒体基因组类型。因为它们的大多数SNP属于mt-B，所以这3个菌株都包含在mt-B中。图2. ITS2和20个菌株的线粒体基因组的群体分析。（a）使用ITS2数据构建NJ树。每个菌株的不同ITS2序列分别标记为c1，c2，c3和c4。（b）使用SNP数据构建NJ树。（c）PCA分析。（d）群体结构分析，群体A：紫色；群体B：蓝色。
3、mt-A1、mt-A2和mt-B之间的SNP和indel多样性通过测试mt-A1、mt-A2和mt-B之间SNP和indel的差异显著，mt-B中的SNP和indel数量明显高于mt-A1和mt-A2。mt-A2中的插入缺失的数量明显高于mt-A1。mt-B中同义和非同义突变的数量与mt-A1和mt-A2的相同。mt-A1和mt-A2之间的存在40个不同SNP（图3a），基因间区域中有36个SNP，cox1（orf202和orf190）的2个内含假设蛋白编码基因中有2个SNP，rrnS中有1个SNP。mt-A和mt-B之间的304个不同SNP（图3b）。 图3.不同线粒体基因组类型之间的SNP。（a）mt-A1和mt-A2之间的SNP。（b）mt-A和mt-B之间的SNP。位点（红色）：CDS中的非同义SNP；位点（绿色）：CDS中的同义SNP；位点（黄色）：CDS中的终止子缺失SNP。
4、用于识别mt-A1, mt-A2和mt-B的标记基因 为了筛选鉴定mt-A1，mt-A2和mt-B的标记，研究测序了mt-B中完整的YAASM363线粒体基因组，并与NCBI香菇线粒体参考基因组（NC_018365.1和KY217797.1）用于系统发育和共线性分析（图4）。NC_018365.1与L135在基因数量和排列方式上具有良好的一致性，属于mt-A1。KY217797.1的线粒体基因组属于mt-A2。对这四个线粒体基因组的15个编码蛋白基因和2个rRNA基因比对（图4a）。基因atp6, atp8, atp9, cox2, nad4L和nad6相同。基因cob, cox3, nad2, nad3, nad4, nad5, rps3和rrnS在mt-B和mt-A的两个分支之间不同，而在mt-A1和mt-A2之间只有很小的差异。可用作识别mt-A和mt-B的标记基因。四个线粒体基因组的cox1, nad1和rrnL基因都完全不同，可以用作鉴定mt-A1，mt-A2和mt-B的标记基因。 图4. L135，NC_018365.1，KY217797.1和YAASM363之间完整的线粒体基因组NJ进化树（a）和共线性分析（b）。
总结
本文基于Illumina（450 bp）和PacBio（8-10 kb）测序数据组装了L135和YAASM363的完整线粒体基因组。并对19个香菇线粒体基因组重测序，用于分析两个香菇种群的遗传多样性和结构。这表明在这两个种群之间可能需要频繁的遗传交换，核基因和线粒体标记都必须用于香菇菌株的鉴定。此外，SNP多样性分析表明可使用cob, cox3, nad2, nad3, nad4, nad5, rps3和rrnS基因鉴定mt-A和mt-B，并且cox1, nad1和rrnL基因可用于识别mt-A1，mt-A2和mt-B。本文对于研究中国香菇种群分布和分型具有重要意义。
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