ChromatinImmuno Precipitation(ChIP) protocol

ChromatinImmuno Precipitation(ChIP) protocol

1，1*250px 80%密度的细胞1%甲醛室温固定8min，0.125M甘氨酸终止固定，5min。（个人使用37%浓度的甲醛，细胞培液是10mL，这样就加入278μl。甘氨酸自配2.5M，这样就加入540μl）。

2，预冷的PBS清洗两次，并用细胞刮刀收集细胞到1.5mL EP管中，1000g 3min，去上清。

3，加入600μl预冷ChIP lysis buffer,3μl Proteinase Inhibitor，吹匀分到两个1.5ml EP管（普通EP管就行）中并超声。超声仪为BioruptorUCD-200。（设置超声功率为High，时间on：30s，off：30s，一次超声时间为10min。）超声总时间需要摸索。以Huh7细胞为例，一次超声时间为10min，重复5次，因此超声总时间为50min。注意：超声要用冰水浴，效果最好！同时加入的冰水浴要刚好到达仪器指示的刻度线。

4，超声之后17000g 离心10min。回收上清混匀并为一管。取30μl到新的2ml EP管中（剩下的先-80 °C冻存），加入120μl Decrosslink buffer，68°C解交联3h。之后再加入120μl 50mMTris-HCl 8.0，2μl RNaseA，2μl Proteinase K，混匀，55°C消化1h。然后加入600μl Bindingbuffer(Qiagen)，混匀过柱，20μl洗脱回收，跑Argrose胶验证超声长度。（以Huh7为例，超声总时间为50min，DNA超声片段长度大约为100-250bp，这样有利于测序。）

5，成功超声到目的长度片段后，将冻存的超声上清取出置于冰上。

6，吸取30μl proteinG beads（life），500μl NT2 buffer洗两次，洗完后加入400μl NT2buffer分为两管(1.5ml低吸附EP管)，加入3μg 目的蛋白抗体以及IgG抗体，室温孵育30min（on rolling incubator）。

7，磁力架回收beads，去NT2 buffer，加入超声250μl上清到目的蛋白-beads管中，和IgG-beads管中，4度孵育6-8h，可以孵育过夜（on rolling incubator）。留2.5μl上清当做1%input.

8，磁力架回收beads，500μl Washbuffer 1洗两遍，一次5min，（on rolling incubator），500μl Washbuffer 2洗两遍，一次5min，500μl Wash buffer 3洗一遍。

9,将1%input，目的蛋白以及IgG三管转移到2ml低吸附EP管中，加入60μl Decrosslinkbuffer，68°C解交联3h或者65°C解交联4h以上。之后再加入60μl 50mMTris-HCl 8.0，2μl RNaseA，2μl Proteinase K，混匀，55°C消化1h。然后加入600μl Bindingbuffer(Qiagen)，混匀过柱（DNA minElute柱），600μl Wash buffer洗两次，12000g空离2min，20μl Elutionbuffer洗脱回收并测浓度，10μl稀释做qPCR实验，剩下保留去建库测序。