易位性肾细胞癌的基因组分析揭示拷贝数改变是疾病进展的驱动因素

Comprehensive Genomic Analysis of Translocation Renal Cell Carcinoma Reveals Copy-Number Variations as Drivers of Disease Progression10.107Clin Cancer Res . 2020 Jul 15;26(14):3629-3640. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-3283. Epub 2020 Mar 27.

Abstract

Purpose: Translocation renal cell carcinoma (tRCC) is a rare, aggressive renal cell carcinoma (RCC) subtype. There is currently limited understanding on the role of molecular alterations in the pathogenesis and progression of these tumors. We investigated the association between somatic alterations and clinical outcomes in two independent cohorts profiled using DNA sequencing.   Experimental design: Twenty-two tRCCs underwent targeted sequencing [Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)-IMPACT]; a subset was profiled using exome-sequencing and combined with exome data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) for analysis. The prognostic value of specific somatic aberrations, tumor mutation burden (TMB), and fraction of copy-number-altered genome (FCNAg) was explored. In TCGA cases, neoantigen prediction and immune cell deconvolution were performed using RNA-sequencing and exome data. Overall survival estimates were computed using the Kaplan-Meier method; time-on-treatment was calculated for 14 MSK-IMPACT patients who underwent systemic therapy. Associations between molecular features and outcomes were evaluated using nonparametric testing.   Results: Copy-number aberrant tRCCs were associated with poor overall survival (P = 0.03). Pediatric patients had tumors with lower FCNAg (P = 0.01). In one adult case with two chronologically distinct tumor samples sequenced, we confirmed that copy-number events occurred early during evolution. TERT promoter mutations were found exclusively in high-stage tumors. We found that tRCCs displayed distinct angiogenesis and PD-L1 gene expression profiles compared with other RCC subtypes.   Conclusions: Tumors molecularly defined by increased copy-number variations were associated with aggressive disease in tRCC. A higher burden of genomic events in adults compared with pediatric cases likely reflects a more aggressive clinical course. The unique immunophenotypic characteristics of tRCC merit further exploration.

一．研究背景
易位性肾细胞癌（tRCC）是一种罕见的侵袭性肾细胞癌亚型，其发病机制是转录因子TFE3或TFEB与潜在转录活性位点融合。然而，目前对于分子改变对其发病和进展作用的认知还十分有限。并且对于这种罕见的侵袭性肾细胞癌亚型，尚没有有效的预后生物标志物，也没有晚期疾病的治疗标准。此外，以往对tRCC中复发性基因组改变的分析仅限于相对较小的组群，主要集中于拷贝数变异(CNVs)的分析。并且只有少数tRCC患者被纳入肾细胞癌系统治疗的临床试验中。因此，在这篇文章中作者使用DNA测序分析对两个独立队列进行研究，探索了体细胞改变和临床结局之间的关系。
二．材料及方法
1. 样本：发现集：MSK-IMPACT队列中样本的全外显子序列。‚验证集：TCGA-exome 队列，在TCGA-KIPAN中获得tRCC的RNA-seq数据以及外显子序列数据。
2. MSK-IMPACT靶向序列：使用先前经过验证的序列panel(MSK-IMPACT)对肿瘤和对应的正常样本进行下一代测序。
3. 全外显子序列的处理及突变分析：使用Burrows Wheeler aligner (BWA)对fastq格式的原始测序数据与人类参考基因组进行比对。使用基因组分析工具Toolkit进行重排。使用MuTect2 , Strelka2, Varscan和Platypus四种工具得到突变calling。
4. 等位特异的拷贝数分析：使用FACETS算法进行等位特异的拷贝数分析。基因组分割后，根据其CN整数值将每个片段分为二倍体和非二倍体。
5. 评估肿瘤突变负荷（TMB）：考虑所有非沉默的外显子突变来计算TMB，并根据杂交试验中覆盖的总基因组长度对其进行校正。
6. 肿瘤细胞得分（CCF）分析：CCF≥0.9的突变被定义为克隆，其他所有突变被认为是亚克隆。使用该定义，通过亚克隆和克隆突变的数量来计算肿瘤内异质性(ITH)指数。
7. 新抗原预测与免疫细胞去卷积：使用INTEGRATE从RNA-seq数据中识别基因融合。用POLYSOLVER识别HLA等位。接着作者使用INTEGRATE-neopipeline进行融合蛋白的新抗原预测。作者进一步使ssGSEA评估了tRCC病例和其他RCC组织中与血管生成,PD1, PD-L1 ,CTLA4相关特征表达的差异。
8. 生存分析：使用Kaplan-Meier，log-rank检验进行生存分析。
三．研究的主要内容及结果
1. 患者特征
在文章的第一部分，作者首先对研究中纳入的样本特征进行了刻画。其中MSK-IMPACT 队列中22个tRCC患者的临床及基因组特征如图1所示。而pan-kidney (KIPAN) TCGA 队列中有10个样本纳入了后续分析。可以观察到在TFE3 (n=20)和TFEB (n=2)中均发现了基因融合，MSK-IMPACT队列和TCGA队列的中位随访时间分别为27.1个月和41.4个月。

图1 研究队列的临床及遗传特征
2. tRCC的体细胞驱动突变、肿瘤突变负荷、瘤内异质性和融合肽的免疫原性
由于以往对tRCC肿瘤的分析局限于相对较小的群组，因此其检测复发性体细胞突变的能力有限。所以在这里作者首先关注分析了MSK-IMPACT队列中的体细胞突变。研究发现在排除TFE融合和拷贝数改变后，68.2%患者表现出体细胞单核苷酸变异或插入和缺失, 22.7%样本中存在潜在的致癌驱动突变。作者在3例患者中发现了激活TERT启动子突变(C228T)，这些突变均发生在AJCC高期，表明TERT的激活可能是侵袭性tRCC的一个新的标记。接着作者使用等位基因特异性拷贝数分析定量确定了假定的致癌突变的克隆性，结果发现只有ATM突变伴随着杂合缺失，表明该病变可能是肿瘤发病机制中主要驱动事件。

高肿瘤突变负荷(TMB)已被用作许多实体肿瘤的生物标志物。因此作者使用外显子序列计算了两个队列的TMB，并对不同队列的TMB进行了比较，可以观察到TCGA 和MSK-exome组之间的TMB是一致的，进一步与其他RCC亚型相比，发现tRCC的TMB有明显的不同（图1）。接下来，作者使用总体瘤内异质性指数来概括体细胞突变的克隆性，发现与亚克隆事件相比，克隆事件的发生率更高。总之，这些结果表明，从突变的角度来看，tRCC肿瘤表现出突变负荷相对较低、正常致癌突变事件相对较少，同时，在肿瘤抑制基因功能缺失突变的情况下，野生型等位基因很少同时发生杂合缺失。

接下来，作者评估了有外显子组和RNA-seq数据的TCGA-tRCC样本的免疫原性和肿瘤微环境组成。作者还使用免疫去卷积方法来检测ccRCC中血管生成和三个免疫治疗靶点(PD1、PD-L1和CTLA4)的基因特征差异。结果发现，tRCCs中的血管生成基因表达特征较高，与KIRC和KIRP队列相比，tRCCs也显示了更高的PD-L1表达特征，然而，CTLA4和PD1没有显著差异。
3. 拷贝数改变的预后意义
先前的研究认为，tRCC中9p染色体臂水平的丢失和17q的扩增是常见的，并且17q扩增是潜在的预后标志物。与之相比，该研究使用了等位基因特异性拷贝数分析，可以更敏感地检测杂合性的获得和拷贝数中性损失事件。这一部分，作者开始评估总拷贝数事件与tRCC的临床特征和OS之间的关系，计算基因组中出现拷贝数变化(FCNAg)的比例。结果发现，在TCGA队列中，高AJCC期(III/IV)与高FCNAg相关，但在MSKIMPACT队列中没有达到统计学意义(图2)。

接下来，作者分析了MSKIMPACT队列中的拷贝数变化，观察到3/3的TERT突变出现在9p缺失的肿瘤中，并且在两个队列中，9p缺失的存在与较高的FCNAg显著相关（图3）。由于tRCC具有相对较低的TMB和相对较高的拷贝数改变频率，作者对临床结局和拷贝数改变之间的联系进行了评估。作者定义了一个拷贝数异常（CNA）队列，这些患者要么有9p损失，17q增加，要么FCNAg高于队列中位数。结果发现，MSKIMPACT队列中拷贝数异常(CNA)肿瘤患者的总体生存率较差，TCGA队列中也发现了相似结果。因此，可以推断拷贝数改变与较差的临床结局有关。

图2 FCNAg与AJCC分期和9p缺失的关系

图3 不同队列中的拷贝数改变及与生存的关系
4. 转移性tRCC肿瘤的时序进化
在这一部分，作者对一名最初诊断为高级别乳头状肾细胞癌后期出现复发转移的患者进行分析。研究发现与之前的标本相比，局部复发的肾脏有一致的形态学特征，以及TFE3基因重排，其中一个腹膜后淋巴结活检也发现有PRCC-TFE3融合。为了了解肿瘤的克隆相关性，作者对淋巴结转移进行了外显子组测序，比较了拷贝数改变和突变。结果发现这两个样本都显示出全基因组加倍(WGD)和整个基因组广泛的拷贝数改变，且FCNAg异常高，9p染色体的损失在两个样本中都很明显，它在WGD事件之前。这些发现与CNVs是肿瘤发展的早期事件相一致。相比之下，两种肿瘤之间只有23%的体细胞突变是共享的，表明在最近的共同祖先分化后发生了广泛的突变多样化。这些结果表明在这个特殊的tRCC肿瘤中，拷贝数的改变发生在肿瘤进化的早期，而大部分体细胞突变发生在后期，可能反映了转移性tRCC与原发性tRCC不同的进化模式(图4)。

图4 1例tRCC患者的时序进化
5. MSK-IMPACT队列中tRCC患者对系统治疗的反应
在这一部分作者评估了14名接受多系统治疗的MSK-IMPACT队列患者的治疗反应，14名患者中有5名在一线或二线治疗中显示TOT延长。对有反应者和无反应者相比较观察到FCNAg中位数没有差异。作者没有发现治疗反应和基因组特征之间的任何联系。分析发现ICB治疗反应时间延长的患者中SMARCA4和PBRM1的两个基因存在错义突变，这两个基因的变异都与免疫原性特征有关。图5显示了对一线或二线系统治疗反应延长的tRCC患者的治疗过程和基因组特征。

图5 治疗反应延长的tRCC患者的治疗过程和基因组特征
6. MSK-IMPACT队列中的儿童tRCC病例
在研究的最后，作者评估了18岁以下患者的分子改变，它们的发病部位和治疗过程如图6所示。有两名患者之前接受过化疗:一名是视网膜母细胞瘤患者，也有证据表明存在生殖系RB1突变。分析发现没有一个儿科病例显示9p损失或17q增加，并且，与他们的同龄人相比，也发现他们FCNAg显著低。

图6 儿童病例的疾病部位和治疗过程

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，总结一下，研究中作者对不同队列tRCC患者的外显子序列数据进行分析，结合多种生物信息方法研究特异性体细胞改变、肿瘤突变负荷(TMB)和基因拷贝数改变(FCNAg)的预后价值。最终发现拷贝数改变在tRCC中普遍存在，并可能导致不良预后。在成人患者中，致癌事件频率的增加可能是导致更侵袭性疾病表型的原因。

转自生信人

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