客户文献|《Molecular Ecology》揭示灰飞虱线粒体变异与多种性状相关并且反映复杂的进化轨迹

线粒体基因组与不同气候条件的适应性进化有关，但是线粒体适应性进化的驱动力及其背后的机制尚不清楚，使得线粒体单倍型与生物表型之间的联系仍然是一个挑战。

合作客户南京农业大学在《Molecular Ecology》（IF=5.855）发表最新关于灰飞虱线粒体基因组以及群体进化研究。

灰飞虱（Laodelphax striatellus）隶属半翅目，飞虱科，是一种非常重要的农业害虫。不仅可以以刺吸直接危害水稻，还是多种水稻病毒传播的媒介，灰飞虱耐寒怕热， 在世界上分布范围广泛，主要分布在温带地区。
灰飞虱
线粒体-核基因分化不一致（mito-nuclear discordance）常发生在灰飞虱（SBPH, Laodelphax striatellus）中，前期种群遗传构研究发现灰飞虱种群中存在两种线粒体单倍型群 HGI和HGII，两种单倍型群的地理分布与环境温度具有显著的相关性。而相比于很强基因流的HGII，HGI在中国寒冷的气候地区更为常见。
研究中的灰飞虱SBPH群体来自中国的17个地区和日本的6个地区（下图1）。除MDJ（2012年），YJ（2010年）和XZ（2012年）外，大多数中国群体（14/17）在2010年进行了抽样，2017年对所有日本群体进行了抽样。立即将样品保存在无水乙醇中，然后在实验室中于-20°C储存直至提取DNA。
研究对81个线粒体基因组进行测序组装，早期研究表明ND2、ND5和CYTB基因中的非同义变化与两个线粒体单倍体的差异密切相关。为了进一步验证群体变化是否对灰飞虱群体水平的气候适应做出响应，研究分析了17个中国群体和6个日本群体中这三个基因的遗传变异，寒冷昏迷恢复，繁殖力和mtDNA复制丰度等。
图1 ND2、ND5和CYTB中三个非同义替换的地理分布。（a）中国群体。（b）日本群体。Bio11，最冷季度的平均温度；MT，温带气候；WT，温暖的温带气候；NS，北部亚热带气候；MS，中亚热带气候；WC，大陆性气候；TC，温带大陆性气候；WO，温暖的海洋性气候。黄色表示属于HGI的氨基酸类型的种群频率，蓝色表示属于HGII的种群频率。频率条按采样位置纬度的顺序排列。

研究成功地扩增和测序了81个线粒体基因组（GenBank登录号：MK292897-MK292977）。13个线粒体蛋白基因（无终止密码子）的串联序列的总长度为10839 bp，未观察到插入缺失或产生提前终止密码子。在246个位点发现了SNP，核苷酸多样性为0.286%。通两个谱系之间的平均K2P遗传距离为0.4%，表明典型的种内差异。相对于HGII（0.117％），在HGI（0.189%）中检测到相对较高的核苷酸多样性（下图2）。SPLITSTREE系统进化分析进一步证实，存在两个不同的线粒体谱系HGI和HGII。总的来说，鉴定出ND2、ND5和CYTB基因的三个非同义变化与两个谱系的差异密切相关。
图2 不同有丝分裂基因组单倍型之间的系统发生关系。（a）从13个线粒体蛋白质基因的串联中推断出的ML系统发育树。黄色背景的分支属于HGI，蓝色背景的分支属于HGII。ML树和BI树都支持单调，并且表明HGII最近来自HGI。与两个谱系的发散相关的非同义变化在每个分支附近标记。具有不同形状的符号代表每个基因中不同的氨基酸位点，其颜色反映具有该变异体的常见单倍体。（b）基于13个线粒体蛋白基因的串联的单倍型分裂网络。

为了进一步探索这三个基因的进化，研究人员成功分离了涉及完整的ND2基因（957 bp），部分ND5基因（400 bp）和几乎完整的CYTB基因（1060 bp）的序列用于1054、1064和1041个样品分别代表23个地理区域的群体。ND2、ND5和CYTB基因分别鉴定了74、31和86个单倍型（下图3）。SBPH群体对ND2（0.780和0.297%），ND5（0.596和0.191%）和CYTB（0.736和0.302%）基因分别具有中等高的单倍型多样性和低核苷酸多样性。
基于这三个基因非同义突变，我们将单倍型分为两个亚组。尽管两个亚组都广泛分布在五个气候带中，但观察到了不同的拓扑模式。HGI亚组显示出一个星形模式，以一个单倍型为主。相反，HGII亚组由几个亚谱系组成（下图3）。
图3 ND2，ND5和CYTB基因的单倍型网络。根据ND2基因的1041个序列（957 bp），部分ND5基因的1064个序列（400 bp）和部分CYTB基因的1041序列（1060 bp）构建单倍型网络。色标：MT，温带气候（中国）；WT，温暖的温带气候（中国）；NS，北亚热带气候（中国）；MS，中亚热带气候（中国）；WC，温暖的大陆性气候（日本）；WO，温暖的海洋气候（日本）。黑色的阴影线表示同义突变，红色的阴影线表示非同义突变。圆的大小与单倍型频率成正比。

在中国群体中观察到了两个单倍群频率变化，与HGI相关的非同义变化随着纬度的增加而增加。然而，这种模式在日本群体中并未观察到，在日本群体中，HGII在所有群体中均占主导地位，最北部的群体（SAP）的HGII频率最高。Mantel测试显示，当排除地理隔离的影响时，非同义变化频率的差异与最冷季（Bio11）的平均温度显着相关（ND2: r = 0.419, P = 0.001; ND5: r = 0.597, P = 0.001; CYTB: r = 0.351,P = 0.002; 图4a-c），表明最低温度会影响非同义变化的地理分布。

当排除种群之间Bio11影响时，除ND5外，非同义突变的频率差异和地理距离之间的差异也较弱（图4d-f）。这些结果表明，温度和地理隔离都在塑造非同义变化的地理分布中发挥了作用。

图4非同义变化频率与最冷的四分之一平均温度（a-c）和地理距离（d-e）之间的关系。Bio11，最冷季度的平均温度；CHN.CHN表示中国群体的成对比较；CHN.JP表示中国和日本群体之间的成对比较；JP.JP表示日本群体的成对比较。

中日之间的遗传分化（平均FST ND2: 0.195, ND5: 0.227, CYTB: 0.241）比中国群体（平均FST ND2: 0.123, ND5: 0.147, CYTB: 0.107）或日本群体（平均FST ND2: 0.076, ND5: 0.198, CYTB: 0.076）之间的遗传分化更强观察到。Mantel检测表明，排除地理隔离的影响后，种群遗传分化（FST）与Bio11的差异显着相关（下图5a-c）。
为了具体探讨HGII mtDNA的进化是否与气候适应有关，观察到群体遗传分化（FST-HGII）与ND2和CYTB的最低温度之间存在强相关性（图5d和5f），但不适用于ND5（图5e）。此外，当排除种群之间的最低温度差异时，三个基因的FST与地理距离之间均未发现显着相关性。
图5群体遗传分化与最冷季平均温度绝对差之间的关系。（a-c）：使用所有序列计算的FST值；（d-f）：使用仅属于HGII的序列计算的FST值。

通过SEM分析获得了相似的结果。非同义突变频率的差异可以通过最冷的四分之一的平均温度（Bio11）和地理隔离显着地解释，而Bio11解释比例更高（表1），这表明最低温度在塑造非同义变化的地理分布方面起着关键作用。
SEM分析还显示，FST变异由Bio11以及ND2和CYTB基因的地理距离显著解释，而由Bio11解释比例更高（表1）。对于ND5基因，模型拟合得分（AIC）表明，仅包含Bio11的模型提供了最佳拟合，其中占59.1%的变异。
对于FST-HGII，AIC提出了仅包含对ND2和CYTB基因最佳的Bio11的模型，但仅包含地理距离的ND5基因的模型更好。对于ND2和CYTB，Bio11可以解释超过77%的FST-HGII变异。相反，对于ND5地理距离影响较弱。

ND2和ND5基因编码线粒体复合体I的亚基，构成复合体I中四个质子泵中的两个（图6a）。ND2中的氨基酸变化M114T伸入NDUFA10的N端可能占据的空间。尽管ND2和NDUFA10之间可能存在相互作用，但无法准确预测这些相互作用，因为在目前所有现有的脊椎动物复合体I结构中，此处的分辨率均较差。
由于同源性低，ND5中的M93L难以预测，但可能会影响β-H环结构的运动（图6b）。CYTB基因编码线粒体复合体III的核心亚基（图6c）。推测CYTB中的F231I可能与CYC1中的残基相互作用，可能通过空间位阻改变CYC1与CYTB的接近度，因为异亮氨酸产生的空间位阻比苯丙氨酸少。
图6人的线粒体复合体I和细胞色素bc1（复合体III）的三维晶体结构。氨基酸变化的模型（a）ND2中的M114T，（b）ND5中的M93L，（c）CYTB中的F231I。


广义线性混合模型（GLMM）分析显示，线粒体基因型（Mit），种群来源（Pop）以及线粒体基因型与核背景之间的相互作用（Mit×Nu）显着影响冷昏迷恢复时间（图7a）。但是，与我们的假设相反，具有HGII线粒体的SBPH通常比具有HGI线粒体的SBPH恢复得更快，但在北部群体（YS）核背景下除外。此外，除了北部群体的YS-MitIINuII品系具有最短的恢复时间外，南部群体（CX）的恢复时间比北部群体要短。
SBPH的繁殖力控制复杂，带有HGII线粒体的SBPH比带有HGI线粒体的产卵更多，除了CX群体中具有NuI核遗传背景的品系（图7b），可能是其在温暖地区的高频率所致。且CX种群的卵产量比YS种群高。GLM分析显示，核背景对雌性胫骨长度的影响较弱。没有检测到线粒体类型的显着影响，表明生殖力差异与体型没有强烈关系。
图7雌性不同SBPH系之间的抗寒性和繁殖力的比较。（a）SBPH系中雌性平均冷昏迷恢复时间。（b）每个SBPH系雌性产卵的平均数量。

GLM分析显示，线粒体类型和性别显著影响mtDNA拷贝数（下表2）。在雌性和雄性灰飞虱中，相对于HGI，HGII线粒体始终具有更多的mtDNA拷贝（图8）。表明两种类型的线粒体在复制和功能效率上存在差异。mtDNA的拷贝数具有两性性，在雌性中拷贝数较高（F1，35 = 21.51，P <0.0001），这与先前对果蝇的研究一致。

图8比较了不同SBPH品系之间mtDNA拷贝数的丰度。（a）雌性。（b）雄性。通过线粒体基因组的平均测序深度与三个核基因的平均测序深度之比来计算mtDNA复制丰度。Mit代表线粒体单倍型。Nu代表核遗传背景。CX代表楚雄群体，YS代表延寿群体。



总结

SBPHs是研究线粒体-核相互作用机制的有效模型。灰飞虱冷昏迷恢复测试和群体遗传测试均表明HGII参与了冷适应。系统发育分析表明，HGII嵌套在HGI中，ND2、ND5和CYTB的非同义突变可能增加了mtDNA的拷贝数，SBPH的耐寒性和繁殖力，影响线粒体-核基因相互作用。在中国的寒冷气候地区，HGI的高发生频率仍无法解释，但讨论了几种可能的原因。总体而言，本研究指出了mtDNA变异与生物体水平进化之间的联系，并暗示了线粒体-核基因相互作用在维持mtDNA多样性中的可能作用。


【参考文献】

Mitochondrial variation in small brown planthoppers linked to multiple traits and likely reflecting a complex evolutionary trajectory. Molecular Ecology, 2019.

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