抗体芯片在结肠癌信号通路研究上的应用

杂志名称：The Journal of Clinical Investigation

文献题目：Metastasis-associated PRL-3 induces EGFR activation and addiction in cancer cells

实验用品：AAH-PRTK-1 & AAH-GF-1抗体膜芯片

AAH-PRTK-1 (71个酪氨酸激酶受体磷酸化抗体芯片)

AAH-GF-1（41个生长因子抗体芯片）

实验样品：AAH-PRTK-1-细胞裂解液 （1.2mg总蛋白）；AAH-GF-1-细胞培养上清（无血清DMEM培养基）；

研究背景：蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs与蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases，PTK）共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。PTP活性的失调导致酪氨酸磷酸化的异常，与各种疾病包括糖尿病，类风湿性关节炎，癌症等的发生发展有密切关系。PRL-3（Phosphatase of Regenerating Liver-3）是近年发现的属于蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs（Protein Tyrosine Phosphatases）家族的成员，其在18个大肠癌的肝转移病人中存在高表达现象，在相应的原发肿瘤和正常上皮细胞中表达水平较低。与转移相关的蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3在推动癌症进展中起到多方面的作用，但PRL-3的信号作用机制仍然不完全清楚。

研究思路

1、细胞培养和转染

细胞系： a、A2780：卵巢癌细胞；b、HCT116：结直肠癌细胞；c、A431 人表皮鳞癌细胞；d、MDA-MB-468 人乳腺癌细胞

细胞转染：a、EGFP (vec)转染；b、EGFP-PRL-3转染；c、pFLAG(vec)转染；d、pFLAG-PTP1B转染；

2、细胞刺激实验

EGF刺激细胞，80%铺满的单细胞层用PBS清洗后，换用无血清培养基培养16h，EGF 100ng/mL刺激20min后收集细胞裂解。

3、RayBiotech抗体芯片检测

AAH-PRTK-1芯片检测细胞内酪氨酸受体磷酸化水平。

AAH-GF-1芯片检测细胞上清中生长因子表达水平的变化。

芯片结果揭示PRL-3过表达激活A431细胞中的EGFR的活性

WB结果表明PRL-3激活EGFR的活性依赖于胞质酪氨酸激酶SRC的活性，细胞上清的芯片检测结果表明PRL-3激活EGFR的活性可能与自分泌刺激无关

4、WB、RT-PCR检测磷酸化、验证芯片结果

5、免疫荧光、细胞增殖实验、基因芯片检测、克隆形成、肿瘤移植实验

从试验结果中可以得出，PRL-3通过下调PTP1B诱导EGFR 高度磷酸化

图中清楚揭示PRL-3通过PTP1B快速激活EGFR，从而引起肿瘤细胞加速发展

6、统计分析 T检验，方差分析，非参数U检验、Spearman秩检验、K-M生存分析

实验结果：本研究表明，PRL-3诱导EGFR过度活化，并在多种人类癌症细胞系中引起其下游信号级联反应。 PRL-3诱导活化EGFR主要归因于转录下调蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B, 该磷酸酶对EGFR有抑制作用。从功能上来说，PRL-3诱导EGFR过度激活与细胞生长的加速、迁移以及致瘤性息息相关。此外，PRL-3诱导的细胞倾向于EGFR信号，通过特异性抑制EGFR，致癌属性会明显逆转。临床显示，PRL-3的表达升高可作为异质结直肠癌（CRC）病人对EGFR抗体药西妥昔的治疗有好的反应的预测指标。 对PRL-3驱动的EGFR过度活化及随之而来的EGFR诱导的下游信号的鉴定，开辟了抑制癌症发展新的途径。本研究表明， PRL-3 表达升高是一个重要的临床生物标志物，可以预测哪些病人对anti-EGFR的癌症疗法有效。