UPP1通过诱导免疫抑制性微环境促进肺腺癌的进展

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文章导读

肿瘤微环境（TME）的复杂性是影响肺腺癌（LUAD）进展的关键因素。为了更深入地了解肺腺癌的分子机制，作者对117例肺腺癌患者的样本的377574个细胞进行单细胞RNA测序(ScRNA-seq)。通过关联分析ScRNA-seq数据与bulk数据集，确定了一类与预后相关高表达UPP1的肿瘤细胞。这些细胞主要位于肿瘤侵袭前沿区，与TME中的免疫抑制性成分有更强的关联。细胞因子芯片分析显示，肿瘤细胞中UPP1的上调导致多种免疫抑制因子的分泌增加，其中TGF-β1尤为突出。此外，UPP1的上调还通过PI3K/AKT/mTOR通路提高了PD-L1的表达，从而导致CD8⁺T细胞受到抑制。通过质谱流式细胞术分析，证明了UPP1在形成TME免疫抑制物中发挥功能。通过使用患者源性类器官(PDOs)，发现高表达UPP1的肿瘤增加了对博舒替尼和达沙替尼的敏感性。总之，该研究强调了UPP1在肺腺癌中的免疫抑制作用，这些发现可能为肺腺癌的分子机制提供见解，并促进个性化治疗策略的发展。

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研究背景

尽管随着免疫疗法的引进，肺腺癌的治疗方法取得了相当大的进展，但对于许多患者而言，预后仍然不太好。肿瘤微环境的异质性、治疗后的耐药性以及患者反应差异等挑战使得治疗前景更加复杂。肺腺癌的肿瘤微环境由多种细胞类型组成，包括肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。这些细胞的相互作用形成了免疫抑制性环境，对肿瘤的发生、生长和预后至关重要。

在低糖条件下，UPP1利用尿苷中的核糖维持肿瘤细胞代谢并促进其生长。最近在肺腺癌中的研究表明，UPP1可以调节肿瘤细胞对糖酵解抑制剂的敏感性，从而促进肿瘤生长。有证据表明，抑制UPP1可增强抗肿瘤T细胞的浸润。然而，UPP1在肺腺癌肿瘤微环境中的确切作用及其潜在影响仍有待阐明。

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研究方法

ScRNA-seq；bulk数据集；CyTOF；IHC；mIF；细胞共培养；类器官；生物芯片

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主要结果

01 ScRNA-seq鉴定高表达UPP1的肿瘤细胞以及UPP1和患者预后的关联

作者整合了5个scRNA-seq数据集，对117个患者样本，共计377574个细胞进行分析（1A，B）。基于经典maker基因将这些细胞分为8个主要细胞群（1C）。使用interCNV算法鉴定出49113个肿瘤细胞，并分成20个细胞亚群（1D、E）。使用ssGSEA算法在三个bulk数据集中对肿瘤细胞的相对细胞丰度进行分析，显示有7个细胞群与较差的预后显著相关（1F）。高表达UPP1肿瘤细胞群的功能富集分析表明，这些细胞与癌症相关的生物学过程有关。通过计算UPP1高表达肿瘤细胞群中富集的重要生物过程的平均功能富集分数，并将其与前10个高表达的基因相关联，结果显示UPP1的相关性最显著（1G）。使用组织芯片对UPP1进行免疫组织化学染色，并对UPP1的表达量进行分析。结果显示，UPP1的表达量与肺腺癌患者的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)呈负相关（1H、I）。

图1：肺腺癌ScRNA-seq数据和预后肿瘤细胞群鉴定的综合分析

02 UPP1高表达的肿瘤细胞与免疫抑制性肿瘤微环境相关联

作者对TME中UPP1高表达的肿瘤细胞与其他细胞的相互作用进行分析后发现，其与Foxp3⁺调节性T细胞、MMP11⁺癌症相关成纤维细胞、LAG3⁺PDCD1⁺CD8⁺耗竭T细胞、SPP1⁺M2型巨噬细胞显著正相关。已经有研究报道这四种细胞促进肿瘤进展，而且与免疫抑制性肿瘤微环境相关。进一步的分析显示，UPP1高表达的肿瘤细胞与这四种细胞的相互作用涉及到许多免疫检查点和趋化因子，表明这些细胞的相互作用可能导致形成免疫抑制性肿瘤微环境，而且与肺腺癌患者的不良预后相关。对肺腺癌患者样本的多色免疫荧光染色证实UPP1高表达肿瘤细胞确实与上述四种细胞群存在空间相关性（图2）。

图2：肺腺癌患者样本的多色免疫荧光染色

03 高表达的UPP1以TGF-β1依赖的方式驱动免疫抑制作用

作者使用高通量细胞因子芯片对超表达UPP1的LUAD 细胞系进行了检测（3A）。结果显示多种细胞因子显著上调，其中TGF-β1的上调最为显著（3B）。ELISA结果表明，在肿瘤细胞中UPP1上调后，TGF-β1的分泌水平也显著升高（3C）。作者对CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、THP-1诱导分化的巨噬细胞和HFL1成纤维细胞与超表达UPP1的肿瘤细胞进行共培养（3D）。结果显示UPP1能够促进CD4⁺T细胞分化成CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞，引入TGF-β1中和抗体明显抑制这种分化（3E）。UPP1能够促进CD8⁺T细胞向LAG3⁺PDCD1⁺T细胞耗竭转化，阻断TGF-β1的分泌后，LAG3⁺PDCD1⁺T细胞耗竭的数量显著降低（3F）。过表达UPP1后，巨噬细胞SPP1的表达量明显升高（3G、H），而PD-L1、CD163和CCL20等maker的增加表示其向M2型转化（3I），而用TGF-β1中和抗体处理后，M2型的极化得到了缓解。UPP1可以影响成纤维细胞的基因表达谱（3J），UPP1上调后，CAF分数对应升高（3K），FAP和MMP11等CAF maker的表达量也上升（3L），增强胶原形成、上皮间质转化等肿瘤效应（3O），加入TGF-β1中和抗体可抑制成纤维细胞中FAP和MMP11的表达水平（3P）。

图3：UPP1通过调控TGF-β1发挥功能

04 UPP1通过PI3K/AKT/mTOR通路调控PD-L1的表达

免疫检查点表达是肿瘤细胞逃避免疫防御的关键策略。作者关联ScRNA-seq、bulk数据集、CCLE mRNA和蛋白质表达的数据，分析了UPP1与各种肿瘤免疫检查点之间的相关性，结果显示UPP1与PD-L1的表达显著相关（4A）。用组织芯片对PD-L1进行免疫组织化学染色（4B、C），并结合WB和流式细胞术结果分析（4D、E），证明肿瘤细胞中PD-L1的表达水平与UPP1呈正相关。在高表达UPP1的肿瘤细胞中对调控PD-L1的六种信号通路进行富集分析，发现其中PI3K/AKT/mTOR通路最为活跃（4F）。已有研究报道，PI3K/AKT/mTOR的磷酸化可以调控PD-L1的表达，WB结果也表明UPP1的上调激活了PI3K/AKT/mTOR通路（4G）。抑制UPP1的表达后，再用AKT激活剂SC79进行处理，结果显示通过激活AKT/mTOR可以挽回因抑制UPP1导致下调的PD-L1的表达（4H）。

图4：UPP1调控PD-L1表达的分子机制

05 CyTOF分析证实了UPP1在体内的免疫抑制作用

作者将UPP1过表达、UPP1下调、和作对照的肿瘤细胞分别皮下植入免疫正常小鼠和免疫缺陷裸鼠，使用CyTOF进行分析（5A）。根据maker基因，将TME中的免疫细胞分成六类：B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、髓系细胞、NK细胞和双阴性CD3⁺T细胞（5B）。对于CD4⁺T细胞，UPP1过表达组的免疫抑制性CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的比例显著增加，IL-10的表达水平也升高（5C、D）。对于CD8⁺T细胞，UPP1的过表达导致各种免疫检查点分子上调，CD8⁺T细胞耗竭增加（5E、F），TNFα+/IFNγ+效应CD8⁺T细胞的比例下降（5G、H）。髓系细胞中PD-L1的整体表达增加（5I、J）。在UPP1过表达组中，CD163⁺PD-L1⁺M2型巨噬细胞显著富集（5J），M2型巨噬细胞的IL-4和IL-10表达水平升高（5K）。UPP1过表达组的浸润性成纤维细胞的比例显著增加（5L、M），而且这些成纤维细胞FAP和MMP11的表达也显著增加（5N）。这些结果说明UPP1在肿瘤免疫逃逸和促进体内免疫抑制微环境方面起重要作用。

图5：UPP1超量表达肿瘤中TME特征变化的CyTOF分析

06 抑制UPP1增强CD8⁺T细胞的毒性和抗PD-L1免疫治疗的敏感性

CD8⁺T细胞毒性对于消除癌细胞至关重要，其活性和功能可以显著影响免疫治疗效果。接受抗PD-L1免疫治疗的对照LLC细胞对肿瘤生长没有明显的抑制作用，然而，抑制UPP1表达后，肿瘤增殖受到明显抑制，而且抑制UPP1表达增加了肿瘤对抗PD-L1免疫治疗的敏感性（6A-D）。抑制肿瘤细胞中UPP1的表达增加了浸润性CD8⁺T细胞的比例，在此基础上对小鼠进行抗PD-L1免疫治疗可进一步增强CD8⁺T细胞的浸润（6E）。将UPP1抑制与抗PD-L1免疫治疗相结合，可以进一步增强CD8⁺T细胞的毒性（6F）。

图6：UPP1对CD8⁺T细胞毒性和抗PD-L1免疫治疗的影响

07 对高表达UPP1的肿瘤进行潜在治疗药物筛选

作者从CTRP、GDSC和PRISM药物基因组数据库中收集了数百种癌细胞系的基因表达数据和相关药物反应数据。根据UPP1的表达水平将LUAD患者分为UPP1高表达组和UPP1低表达组，在各种数据库中分析并整合这两组细胞对药物的敏感性，最终筛选出3种药物（7A-E）。进一步的药物实验验证结果显示，UPP1高表达的肿瘤细胞对博舒替尼和达沙替尼更敏感（7F）。用LUAD患者源性类器官测试后发现博舒替尼和达沙替尼都能抑制肿瘤生长，而且高表达UPP1的肿瘤细胞的药物反应更强（7H、I）。

图7：药物筛选和实验验证

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总结讨论

在这项研究中，作者将ScRNA-seq与bulk数据集进行关联分析鉴定出高表达UPP1为特征的肿瘤细胞亚群，该亚群与免疫抑制性TME和较差的LUAD患者预后相关。结合大量数据和实验结果分析，证明UPP1的高表达对于LUAD在形成免疫抑制微环境中发挥重要功能，为肺腺癌的靶向治疗提供了新的思路。

参考文献：