一、研究背景与核心科学问题

阿尔茨海默病（AD）的病理进程具有高度异质性，不同患者在病理特征、疾病进展速度及临床表型上存在显著差异，这给精准诊疗和药物研发带来了巨大挑战。当前AD诊断与分期的核心依据是ATN框架（Aβ沉积、tau病理、神经退行性变），脑脊液（CSF）中的Aβ42、p-tau等传统标志物虽被广泛应用，但难以全面反映AD复杂的分子病理网络，也无法有效解释患者异质性的核心机制。

血脑屏障（BBB）作为维持脑内微环境稳态的关键结构，其功能障碍在AD病理进展中扮演重要角色——可导致脑内有害物质清除受阻、营养物质转运异常，还会引发神经炎症反应，形成恶性循环促进疾病进展。同时，tau蛋白异常聚集和突触功能损伤是AD的核心病理特征，传统观点认为AD患者CSF中tau蛋白水平升高，但近年研究发现部分AD患者存在tau及突触标志物水平降低的特殊情况，其机制尚不明确。此外，脑脊液蛋白质组学技术的发展为解析AD分子异质性提供了有力工具，可通过系统性分析CSF蛋白谱实现AD分型，进而挖掘不同亚型的核心病理机制。

基于此，本文核心科学问题明确为：① 利用脑脊液蛋白质组学技术能否实现AD的精准分型？② 不同AD蛋白质组学分型是否存在血脑屏障功能障碍的差异特征？③ 血脑屏障功能障碍与CSF中tau蛋白及突触标志物水平降低之间是否存在直接关联？该关联能否揭示AD异质性的关键分子机制？

二、研究设计与技术路线

本研究以“脑脊液蛋白质组学检测-AD分型-机制关联验证”为核心框架，通过整合多组学技术与临床数据，系统解析血脑屏障功能障碍与tau、突触标志物的关联，具体设计如下：

1.   研究队列：纳入AD患者、轻度认知障碍（MCI）患者及健康对照人群，收集所有参与者的脑脊液样本（核心检测样本）、临床认知评估数据（如MMSE、CDR-SB评分）、脑影像数据（MRI/PET，用于评估脑内Aβ沉积、tau分布及脑结构变化）及血脑屏障功能相关指标（如通过影像或血液标志物评估屏障通透性）。

2.   核心检测技术：采用高通量蛋白质组学技术（如液相色谱-串联质谱法）对脑脊液样本进行深度检测，系统分析数千种蛋白质的表达谱，涵盖血脑屏障相关蛋白（如血管内皮标志物、紧密连接蛋白）、tau相关蛋白、突触功能标志物（如突触囊泡蛋白、神经递质受体）及炎症相关蛋白等。

由于血浆稀释后，质谱技术（MS）未检测到与磷酸化 tau 蛋白（p-tau）各亚型对应的肽段，因此我们采用 Alamar NuLISA 多重免疫检测法⁵³，对经不同浓度血浆稀释后的阿尔茨海默病样亚型 6 脑脊液中内源性 p-tau₁₈₁、p-tau₂₁₇和 p-tau₂₃₁水平进行了检测。值得注意的是，当向脑脊液中加入更高浓度（2%）的血浆时，可观察到 p-tau 各亚型水平显著下降 —— 亚型 6 脑脊液中 p-tau₁₈₁、p-tau₂₁₇和 p-tau₂₃₁的水平较基线值降低了约 15%（图 7F）。相比之下，用同等浓度的人血清白蛋白（HSA）进行稀释，对 p-tau 水平无显著影响（图 S8B）。

3.   AD蛋白质组学分型：基于脑脊液蛋白质表达谱数据，通过聚类分析（如无监督聚类算法）对AD患者进行分型，筛选不同亚型的特征性蛋白标志物（即各亚型中显著高表达或低表达的蛋白），明确各亚型的分子特征。

4.   关联分析与机制验证：① 对比不同AD亚型与健康对照、MCI人群在血脑屏障功能指标上的差异，明确血脑屏障功能障碍的亚型特异性；② 分析各亚型中tau蛋白及突触标志物的表达水平，聚焦“tau及突触标志物降低”的亚型特征；③ 构建蛋白-蛋白互作网络，挖掘血脑屏障相关蛋白与tau、突触标志物的调控关系，验证血脑屏障功能障碍与tau及突触标志物水平降低的因果关联；④ 结合临床数据，分析不同亚型患者的认知功能衰退速度、病理进展特征，明确分型的临床意义。

三、核心研究结果解读

不同种族与性别的一致性脑脊液蛋白质组学数据集的人群特征与生物标志物分析，（A）用于脑脊液蛋白质组分型的样本收集、处理及分析流程示意图。（B）对队列 1（采用 Luminex 技术，样本量 n=281）和队列 2（采用罗氏电化学发光技术，样本量 n=202）的总 tau 蛋白进行免疫检测，所得 Z 分数与串联质谱标签定量技术（TMT-MS）检测的微管相关蛋白 tau（MAPT）的 log₂丰度呈显著正相关（相关系数 = 0.79，p=2.9×10⁻¹⁰⁴）。（C）总 tau 蛋白免疫检测 Z 分数水平（单因素方差分析：p=2.75×10⁻⁵⁴）；（D）磷酸化 tau181 蛋白免疫检测 Z 分数水平（单因素方差分析：p=1.40×10⁻⁴⁷）；（E）β 淀粉样蛋白 42（Aβ42）免疫检测 Z 分数水平（单因素方差分析：p=4.72×10⁻⁷⁰）。研究样本根据诊断结果分组（阿尔茨海默病组：218 例；对照组：213 例），并按性别（男性：164 例；女性：267 例）和自我报告种族（非西班牙裔白人：320 例；非裔美国人：111 例）进一步分层。对于同一样本配对的情况（n=52），仅纳入队列 1 的样本进行绘图及统计分析。采用三因素方差分析评估种族、性别及诊断因素间的组间差异显著性，并通过 Tukey 事后检验进行校正（p≤0.05；p≤0.01；*p≤0.001；**p≤0.0001）。

无偏网络分析将脑脊液蛋白质组聚类为具有生物学关联的模块，且这些模块与人群特征及临床病理指标存在相关性，（A）采用加权基因共表达网络分析算法（WGCNA），基于蛋白共有的细胞表达特征及生物学功能构建蛋白质网络。该网络共包含 10 个蛋白质模块，模块间的相关性通过聚类树状图展示。通过基因本体（GO）分析明确各模块所对应的核心生物学功能。模块 - 表型关联分析的具体方法为：计算各模块的参与者特征蛋白与各类表型指标间的双相关系数（bicor），涉及的表型指标包括人群特征指标（年龄、性别、种族）、认知功能评分（蒙特利尔认知评估量表）以及病理生理学标志物 [如免疫检测法测得的 β 淀粉样蛋白（Aβ42）、总 tau 蛋白（t-tau）、磷酸化 tau181 蛋白（p-tau）和载脂蛋白 E（APOE）风险评分]。模块 - 表型相关性热图中，红色代表蛋白模块与参与者特征或疾病表型呈强正相关，蓝色代表呈强负相关。对于同一样本配对的情况，仅纳入队列 1 的样本进行计算分析。采用单侧 Fisher 精确检验判定各模块的细胞类型富集显著性（p≤0.05；p≤0.01；*p≤0.001）。（B）针对具有统计学意义的模块，通过单因素方差分析检验，将其特征蛋白值按不同人群分组进行展示。

无偏性脑脊液分型揭示阿尔茨海默病的生物学异质性，鉴定出 6 种不同的蛋白质组亚型，（A） 展示各网络模块中排名前 30 位蛋白的 Z 分数丰度热图，研究对象为经 MonetM1 算法聚类为 6 种亚型的 425 名参与者；热图中黄色代表蛋白丰度升高，蓝色代表蛋白丰度降低。经该算法成功聚类的受试者被归入 6 种亚型中的其中一种（亚型 1：74 例，亚型 2：46 例，亚型 3：83 例，亚型 4：76 例，亚型 5：77 例，亚型 6：69 例）。（B） 各亚型参与者占比与队列总体人群特征占比的对比图，按诊断类型（阿尔茨海默病患者占 51%）、性别（男性占 38%）及自我报告种族（非裔美国人占 25%）分层统计。采用卡方检验评估各亚型占比与总体占比的差异显著性，差异显著的亚型以标注呈现（p≤0.05）。（C） 各亚型参与者的蒙特利尔认知评估量表得分。采用单因素方差分析评估组间差异显著性。（D） 按亚型分层展示的临床病理指标水平，包括免疫检测法测得的 β 淀粉样蛋白（Aβ）、总 tau 蛋白（t-tau）、苏氨酸 181 位点磷酸化 tau 蛋白（p-tau181）以及质谱检测法测得的神经丝蛋白（NEFM）。采用单因素方差分析评估组间差异显著性。（E） 各亚型参与者携带载脂蛋白 E（APOE）ε4 等位基因拷贝数为 0、+1 或 + 2 的比例（上图），以及 APOE 风险评分（下图）；APOE 风险评分基于基因分型结果计算，每携带 1 个 APOE ε4 等位基因计 + 1 分，每携带 1 个 APOE ε2 等位基因计 - 1 分。

网络模块特征蛋白表达模式可区分埃默里亚型，按模块相关性排序，展示六种亚型中各网络模块的特征蛋白表达量分布。图 1 至图 5 显示，在类对照组亚型 1 至亚型 3 中，蛋白丰度呈逐渐上升趋势；图 6 至图 10 显示，在亚型 1 至亚型 3 中，蛋白丰度呈逐渐下降趋势。采用单因素方差分析评估组间差异的显著性。

利用 UMAP 降维投影及 AD 生物标志物验证，在瑞士队列中实现埃默里脑脊液亚型的重复验证，（A）通过 UMAP 算法为重复验证队列（瑞士队列，样本量n=120）的受试者进行亚型判定的研究流程示意图。（B）基于瑞士队列与埃默里队列模块核心蛋白的交集蛋白（log₂丰度，共 167 种蛋白），构建有监督 UMAP 嵌入模型（左图）。将埃默里队列样本映射至该 UMAP 维度空间，在设定对应参数的条件下，98.8% 的样本成功复现了最初鉴定的 6 种亚型。随后将瑞士队列样本投影至该模型（中图），96% 的样本被归为 6 种亚型中的某一类（右图）。（C）瑞士重复验证队列中，免疫检测诊断标志物 β 淀粉样蛋白（Aβ，左图）和 tau 蛋白（中图）的表达趋势，与原始埃默里队列的趋势一致。血脑屏障（BBB）破坏的临床标志物 —— 脑脊液 / 血清白蛋白比值（右图），在被判定为亚型 3 的重复验证队列样本中水平最高。采用单因素方差分析评估组间差异显著性。（D）关键模块 M1、M2、M5 和 M6 中交集蛋白的 Z 分数特征蛋白值，复现了埃默里队列中观察到的表达趋势。采用单因素方差分析评估组间差异显著性。（E）在瑞士重复验证队列的所有亚型中，M1 模块蛋白的表达水平与脑脊液 - 血清白蛋白指数呈高度正相关（皮尔逊相关系数 = 0.66，p=1.8×10⁻¹⁵）。

富含凝血酶等活性血浆来源蛋白酶的 M1 模块蛋白水平升高，与脑脊液 tau 蛋白及神经元相关蛋白模块的表达水平降低呈强关联；且在混合血浆与脑脊液的生理浓度条件下，M1 模块成分可对 tau 蛋白产生剪切作用。（A）在所有亚型样本中，神经元相关蛋白模块的表达水平与 M1 模块水平呈强负相关（M2 模块：相关系数 =-0.83，p=2.04×10⁻¹⁰⁷；M5 模块：相关系数 =-0.70，p=7.49×10⁻⁶³；M6 模块：相关系数 =-0.70，p=1.08×10⁻⁶⁴）。（B）利用 igraph 软件绘制的 M1 模块核心蛋白网络图，其中以红色轮廓标注的为血浆来源的蛋白水解酶，凝血酶（F2）包含在内。（C）脑脊液免疫检测所得的总 tau 蛋白水平与 M1 模块水平呈负相关（相关系数 =-0.37，p=4.1×10⁻¹⁷）。（D）作为一种可剪切 tau 蛋白的血浆来源蛋白，凝血酶的表达水平在亚型 3 中最高，采用单因素方差分析评估组间差异显著性。（E）基于凝血酶特异性剪切的荧光检测法，对各亚型混合样本中的凝血酶活性进行 24 小时动态检测。（F）向混合脑脊液样本中加入凝血酶特异性抑制剂PPACK后，样本的凝血酶特异性剪切活性受到抑制。（G）蛋白质免疫印迹实验结果显示，凝血酶可对生物素标记的重组 tau 蛋白（分子量约 64 kDa）产生剪切作用。

向阿尔茨海默病样亚型 6 脑脊液中稀释血浆，可改变蛋白模块丰度并降低 tau 蛋白及突触蛋白水平。（A）亚型 6 脑脊液血浆稀释实验流程示意图：向混合的亚型 6 脑脊液中加入不同体积百分比（0.001%、0.01%、0.1%、1%）的人血浆，孵育 24 小时。随后通过数据非依赖采集质谱技术（DIA-MS）和 Alamar 免疫检测法（额外增设 2% 血浆浓度组）对脑脊液样本进行分析，以探究与亚型 6 相比，蛋白模块丰度及免疫检测 tau 蛋白水平的变化情况。（B）采用数据非依赖采集质谱技术（DIA-MS）对血浆稀释后样本中的蛋白进行定量分析。选取部分蛋白（以其在亚型 6 中的基线水平为参照，以百分比形式呈现）进行分组展示，以阐明与神经退行性变及阿尔茨海默病病理相关的模块（绿 / 黄色标注）、神经保护相关模块（蓝 / 红色标注）中蛋白的耗竭差异，以及这些差异随血浆浓度升高的变化趋势。

混合亚型 6 脑脊液中的内源性磷酸化 tau 蛋白水平，经 24 小时孵育后采用 Alamar 免疫检测法进行分析。各类磷酸化 tau 蛋白亚型的水平。

参考文献：

Proteomic subtyping of Alzheimer's disease CSF links blood-brain barrier dysfunction to reduced levels of tau and synaptic biomarkers，Alzheimers Dement. 2025 Nov;21(11):e70830. doi: 10.1002/alz.70830.