干货|单细胞和空间转录组测序分析思路

1、过滤低质量细胞后进行无监督聚类

2、细胞类型注释：细胞注释的思路首先是对大类进行细胞注释，后对关注细胞类群重新聚类后，进行亚类注释。以下图为例，研究者首先将细胞类群分为髓系细胞、NK&T 细胞、B&浆细胞、上皮细胞、内皮细胞等7大类细胞，后续研究者对髓系细胞和NK&T 细胞又进行重新聚类并进行亚类注释。这种以大及小的细胞定义方式，可以更精细和准确地对细胞进行分类。细胞注释一般采用自动和手动方式进行注释，常见的细胞注释软件如singleR，手动注释的marker gene可以摘自文献也可以查照对应的数据库，比如cellmarker2.0，这里可查询到人和小鼠各类组织细胞对应的marker gene集。细胞注释完成后，文章展示注释后的tSNE或UMAP图，此外还需要展示每种细胞的marker基因，展示方式类型有很多，常见的主要有点图、tSNE/UMAP、热图和小提琴图。

3、深入分析：细胞注释后，分析内容主要依附于课题研究目的。如果没有思路，那么单细胞组学还存在一些特定的分析套路。首先我们了解一下，单细胞转录组测序我们可以得到什么，一是细胞种类和数目，二是每个细胞的表达矩阵。

1）对于细胞种类和数目：首先可分析实验组和对照组中各类细胞的比例是否存在显著性差异，甚至出现特定的细胞类群。细胞比例的统计，需注意生物学重复，临床样本建议生物学重复为6个以上。如果这一部分有显著差异，建议后续可采用流式细胞数，对细胞比例进行验证。

2）基于细胞的表达矩阵，可以做哪些分析？最基础的分析内容是差异分析和功能富集分析。相对于bulk 转录组，单细胞转录组的差异分析和功能富集分析，可以指定到您关注的细胞类群，甚至一个或几个细胞。其次，基于研究目的，也有一些现成的分析软件和分析套路，如果您研究的课题和发育增值相关，可以做拟时轨迹相关的分析，分析软件有monocle2/3、RNA速率等；您如果关注细胞间的互作或者免疫微环境，可以进行细胞通讯分析，分析软件有CellChat等；如果您想探寻哪些转录因子起到调控作用，可以进行转录因子分析，分析软件有SCENIC等。

注意：单细胞测序的优势就是可以获得单细胞细胞的组学数据，意味这我们可以对低至一个细胞进行后续分析，也可以对一个亚类进行分析，或者一个大类群进行分析，因为每个细胞的数据都是独立可提取的。

空间转录组单论分析内容的话，基本可以同单细胞转录组，但是因为绝大多数的空转是做不到真实水平的单个细胞分辨率的，所以一般空转多会和单细胞转录组测序一并进行，单细胞转录组进行异质性分析，并辅助对空间转录组spots/clusters进行细胞类型注释。空转数据后续进行免疫浸润等和位置相关的分析。

1、单细胞和空转的联合分析：主要目的即利用单细胞转录组对空转进行细胞类型注释，注释的分析方法有很多，比如MIA、ClellTrek和反卷积法等，反卷积的方法可以做到对每个spot的细胞组成比例进行分析。

2、分析细胞空间位置和占比：确定spot细胞类型之后，可以结合HE染色的结果确定各类细胞空间位置和占比，推断不同细胞在疾病或表型发生中所起到的作用。

3、差异分析和功能分析：确定研究的目的细胞后，可以圈出对应的spots点进行差异分析和功能分析，了解具体的分子调控机制。

注意：空转同单细胞转录组类似，每个spot点的表达矩阵均可以提取出来进行分析。

Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma

文章思路图

1、scRNA-seq整合分析

大类细胞注释、重新聚类并定义小类细胞类型并统计细胞比例

2、针对关注的细胞类型进行分析

线路一：聚焦肿瘤细胞（上皮细胞）

1）发现一类肿瘤组织内特有的角质形成细胞（TSK）

2）确定marker gene、细胞比例差异、功能差异并分析和TSK相关的转录因子

3）与空转结合，确定细胞（TSK和non-TSK）空间位置

线路二：聚焦免疫细胞，分析免疫微环境

1）分类和确定分布位置并聚焦到T细胞

2）免疫微环境研究

3、scRNA-seq和ST-RNA-seq结果验证

1）multiplexed ion beam imaging（MIBI）

2）小鼠模型（敲除鼠，PDX模型）验证

以上是该文章的研究思路，有感兴趣的老师，可阅读全文。

参考文献