首篇HD：GZMK+CD8+ T细胞在鼻息肉中的独特作用

细胞聚类

该研究首先利用了scRNA-seq数据分析初步确定了研究的方向，UMAP聚类确定了25个不同的簇，分别为CD4+ T、CD8+ T、γδT、NK、B、ILC2和髓样细胞等8种免疫细胞，并且CD8+ T是鼻组织中最丰富的亚群。Ro/e评分（用于评估每种细胞类型的组织偏好）揭示：

①CD8+ T、ILC2和髓系细胞在鼻腔组织中富集。其中，γδT和NK细胞在CITs中富集，而ILC2s在NPs中富集。

②CRSwNP患者可以根据嗜酸性粒细胞浸润程度分为嗜酸性（E）组和非嗜酸性（NE）组，ILC2s优先富集于E-NPs，B细胞富集于NE-NPs。

③患者外周血中免疫细胞组成与对照组相似，提示CRSwNP患者仅为局部免疫应答（后面不再对血液的免疫分析）。

CD8⁺ T细胞细分

该实验发现CD8+ T细胞在鼻组织内富集，因此对这些细胞进行了细分，将81202个CD8+ T细胞基于DEGs、典型的标志性基因等特征评分划分为9个转录状态，包括CD8+幼稚T细胞、CD8+组织驻留记忆T细胞、GZMB+ CD8+ T细胞等，在这些细胞类型中，CD8+ TRM、GZMK+ CD8+ T、GNLY+ CD8+ T、NEAT1+ CD8+ T和CD8+循环细胞在鼻腔组织中大量存在。值得注意的是，NPs中GZMK+ CD8+ T细胞增加（该结果通过IF和FLOW进行了湿实验层面的证实），并且这些细胞高表达GZMK和效应记忆T细胞基因特征，但其他颗粒酶低表达，这使它们与其他颗粒酶表达的CD8+ T细胞不同。与之相比，GZMB+ CD8+ T细胞在血液中普遍存在，并且CBL和NP-BL之间、E-BL和NE-BL组之间、E-NP和NE-NP组之间均没有CD8+ T细胞亚型成分没有显著差异。

类群特征

GZMK+ CD8+ T细胞是GZMK的主要细胞来源，并且NPs样本中该细胞在表达GZMK的亚群中占比达77.9%。NPs（NE-NPs和E-NPs）与CITs相比，虽然CD8+ T细胞表现出GZMK水平升高，但GZMK+ GZMB- CD8+ T细胞占比增加，GZMK- GZMB+ CD8+ T细胞的占比则减少，因此细胞毒性标志物水平降低。除此之外，与GZMB+ CD8+ T细胞相比，GZMK+ CD8+ T细胞表达高水平的趋化因子受体（CXCR3和CXCR4）、程序性细胞死亡标志物（PDCD1和PDCD4）、转录因子EOMES和低水平的ZEB2和TBX21，强调了这两种细胞亚群发育的不同机制。

缺乏细胞毒性T细胞特征的GZMK+ CD8+ T细胞的后续转录组分析表明，与其他CD8+ T细胞相比，GZMK+ CD8+ T细胞中，GZMK、主要组织相容性复合体（MHC）II类基因和其它受体相互作用相关基因等均发生显著上调，基因集富集分析也显示该细胞中与IFN-γ信号传导和MHC II抗原预表达等相关的通路显著富集，表明其处于激活状态。

类群状态

对鼻粘膜公开数据集（HRA000772）的分析发现实验组中CD8T_GZMK细胞簇富集在E-NPs和NE-NPs样本中。CD8T_GZMK转录组与该研究中GZMK+ CD8+ T细胞非常相似，显示GZMK、CD27、CD28和MHC-Ⅱ分子的高水平表达，但其他细胞毒性标志物表达水平较低。该数据集中，对D8T_GZMK细胞和结构细胞之间的趋化因子受体-配体相互作用分析发现CD8T_GZMK仅通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞和内皮细胞相互作用，而CXCL12表达的检测显示成纤维细胞是NPs中该分子的主要细胞来源，因此CD8T_GZMB通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞的相互作用比较微弱。

为了深入探索NPs中的细胞相互作用，该研究对3名患者的NP切片和2名对照参与者的CIT切片进行了10X Visium ST (Visium)分析。然而，该方法获得的基因表达水平低，在特定的T细胞类群中均不显著，因此使用了来自scRNA-seq数据的特征基因生成斑点的富集分数来可视化GZMK+ CD8+ T细胞的分布。

GZMK与fibro的邻近与定位

NP9（代表性样本）中的斑点基于空间特征、无偏聚类分析和典型基因表达被分为11个簇，GZMK+ CD8+ T细胞特征分数高的斑点主要分布在固有层内。邻域富集分析显示GZMK+ CD8+ T细胞和成纤维细胞之间的共富集有正相关性，意味着这两类细胞之间在物理上有密切的相邻关系。然而，GZMK+ CD8+ T细胞和上皮细胞之间的共富集并不明显。该研究根据特征评分富集模式GZMK+ CD8+ T/成纤维细胞共富集的斑点定义为内斑点，将其周围的斑点定义为中间斑点（间斑点），内斑点和间斑点都表明这两种细胞类型之间的空间接近，而其他斑点表明两种细胞类型之间的距离显著。此外，ST配受体分析还证实了GZMK+ CD8+ T细胞和成纤维细胞之间通过CXCR4-CXCL12轴的相互作用。

GZMK与fibro的邻近与定位

由于Visium平台无法实现单细胞分辨率（包含1-10个细胞的55 μm斑点），该研究进一步应用2024年新推出的Visium HD平台（10X Genomics，“Visium HD”）来分析另外4个对照样品和6个NP样品。Visium HD空间基因表达平台提供单细胞规模的空间分辨率，具有2 μm× 2 μm栅格方块，且无间隙。为了平衡细胞分辨率和每个栅格的平均转录本计数以进行分析，在该数据集中使用16 μm × 16 μm的栅格大小进行可视化和分析。对于Visium HD数据集，在集成和无监督聚类之后，使用集成的ScRNA-seq数据集（HRA000772 和 GSE175930）作为参考，进行了基于参考数据的反卷积和细胞注释，使用基于参考数据的反卷积在不同样本中分配统一标签有助于我们分析鼻组织中的空间异质性。

GZMK与fibro的邻近（HD）

Visium HD数据提供了多种免疫细胞类型和结构细胞的高分辨率图谱，如代表性样品HD_NP4），这些数据不仅验证了之前的单细胞测序数据，更重要的是鉴定并可视化了这些细胞，甚至在固有层中可视化了CD8T_GZMK和CD8T_GZMB两种细胞。

除此之外，研究通过Squidpy对HD数据进行邻域富集分析发现CD8T_GZMK和成纤维细胞之间存在积极的邻域富集。对于其他结构细胞，内皮细胞与平滑肌细胞表现出强烈的邻域富集，上皮细胞与基底细胞表现出强烈的邻域富集，这与已知的鼻腔组织结构一致。尽管在NPs中，巨噬细胞、浆细胞、CD4+ T细胞和B细胞比GZMK+ CD8+ T细胞更丰富，但它们都没有表现出与成纤维细胞更大的邻域富集，突出了GZMK+ CD8+ T细胞和成纤维细胞的优先共定位（IF验证）。

GZMK与fibro的邻近（验证）

HALO计算成纤维细胞与GZMKCD8 T、GZMBCD8 T细胞、CD4 T细胞或 CD19B细胞之间的距离结果显示，在CIT和NP中，GZMKCD8 T细胞25 μm半径内的成纤维细胞平均数量超过了其它细胞。此外，NP中GZMKCD8 T细胞与成纤维细胞的平均最近邻距离短于其它细胞。鉴于GZMKCD8 T细胞的细胞毒潜力降低及其与成纤维细胞的空间关系，随后的实验集中在GZMK对NPs中成纤维细胞的影响上。研究观察到重组GZMK上调了NP衍生成纤维细胞中许多基因的表达，这些基因包含多种中性粒细胞趋化因子，包括CXCL12。这不仅通过RNA-Seq分析得到了证明，也从额外的细胞培养实验得到了相应的证实，并在湿实验中分别排除了CD4+ T细胞和替代颗粒酶（GZMA和GZMB）的影响。

上调基因和湿实验验证

该研究基于此对HRA000772数据集的重新分析发现，与无鼻息肉的慢性鼻窦炎患者和对照参与者的鼻组织相比，NPs成纤维细胞中IL6、CXCL1、CXCL2和 CXCL8表达水平显着上调。此外，通过免疫荧光染色，在总NPs中检测到MPO中性粒细胞的数量增加，并且GZMKCD8 T细胞的数量与NP中中性粒细胞而非嗜酸性粒细胞的数量呈正相关。

多样性降低

该研究从大约70%的CD8+ T细胞中成功获得了TCR克隆型。

与外周血样本相比，鼻腔组织样本中的克隆扩增更明显，但CITs和NPs中的TCR克隆多样性显著降低，如较低的基于丰度的覆盖率估计量（ACE）、Chao1丰度估计量（Chao）、逆辛普森指数（Inv.Simpson）和Shannon熵分数等。并且不同CD8+ T细胞亚型的克隆扩增程度不同，表现为CD8+ TRM、GZMB+ CD8+ T细胞和GZMK+ CD8+ T细胞在CITs和NPs中都表现出高水平的克隆扩增，并且GZMK+ CD8+ T细胞的克隆扩增在NPs中更明显。

进一步对GZMK+ CD8+ T细胞相关的前100个克隆型细胞分布的研究显示大约20%的克隆型仅在GZMK+ CD8+ T细胞中表现出扩增；其他克隆型则是在GZMK+ CD8+ T细胞、CD8+ TRM细胞和GZMB+ CD8+ T细胞中共享，表明这些细胞间存在克隆转换。并且这些克隆型的分布在NPs和外周血之间表现出明显的重叠，这意味着GZMK+ CD8+ T细胞在血液和组织之间存在迁移。STARTRAC转换分析还强调了GZMK+ CD8+ T细胞和CD8+ TRM细胞以及GZMB+ CD8+ T亚群之间的显著关联。

分化途径

CD8+ T细胞的发育轨迹确定了3条路径，每条路径以CD8+幼稚T细胞开始，随后是CD8+ TRM细胞，路径1以CD8+ MAIT细胞结束，路径2以GZMK+ CD8+ T细胞结束，路径3经过GZMB+ CD8+ T细胞以GNLY+ CD8+ T细胞结束。这些轨迹分析支持GZMK+ CD8+ T细胞和GZMB+ CD8+ T细胞的不同发育路径。

该研究将NPs和CITs中CD8+ TRM、GZMK+ CD8+ T细胞和GZMB+ CD8+ T细胞的前10个最丰富的β链CDR3氨基酸序列输入TCR匹配来鉴定抗原表位和相关抗原，结果发现，NPs和CITs中CD8+ TRM和GZMB+ CD8+ T细胞的TCR序列被映射到来自SARS-CoV-2的表位。相比之下，NPs中的几个EBV表位与GZMK+ CD8+ T细胞的CDR3序列相匹配，而CITs中没有表位与GZMK+ CD8+ T细胞的CDR3序列相匹配。

该研究利用公用数据集，从Ⅱ型炎症性疾病（特应性皮炎、过敏性哮喘和嗜酸细胞性食管炎）、非Ⅱ型慢性炎症性疾病（慢性阻塞性肺疾病和腺性膀胱炎）、自身免疫性疾病（皮肤红斑狼疮和甲状腺炎）和感染性疾病（败血症和乙型肝炎病毒HBV感染）的scRNA-seq数据中收集了108,969个CD8+ T细胞。

公用数据集的验证

分析发现GZMK+ GZMB+ CD8+ T细胞仅占据小部分CD8+ T细胞，即GZMK和GZMB在单细胞内可不共表达，GZMK+ CD8+ T细胞也比GZMB+ CD8+ T细胞在许多慢性炎症组织样本中更丰富，包括特应性皮炎患者皮肤、嗜酸细胞性食管炎患者的食管和十二指肠、桥本甲状腺炎的甲状腺、HBV感染患者的肝脏样本以及皮肤红斑狼疮患者的真皮和表皮。对同时具有CD8+ T细胞和结构细胞的疾病数据集（嗜酸细胞性食管炎的数据GSE175930和红斑狼疮的真皮数据GSE179633）分析发现，GZMK+ CD8+ T细胞在两种疾病状态下通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞相互作用；特应性皮炎的ST数据（GSE197023；n=7）也显示该细胞而非GZMB+ CD8+ T细胞显示出与病变皮肤中成纤维细胞的空间接近，并且CXCR4-CXCL12同样参与GZMK+ CD8+ T细胞和成纤维细胞的相互作用。