【项目文章，IF=64.5】 与瞿介明教授团队合作又一重要研究成果见刊《Cell》
近日，上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授、上海血液学研究所诸江教授、呼吸与危重症医学科李庆云教授、转化医学国家重大科技基础设施（上海）陈赛娟院士共同在 Cell 发表题为Systemic immune profiling of Omicron-infected subjects inoculated with different doses of inactivated virus vaccine 的论文。
该研究通过整合质谱流式细胞技术（CyTOF）、转录组测序（RNA-seq）和血浆微量蛋白的Olink检测技术，首次系统性地描述新冠病毒灭活疫苗接种对奥密克戎感染者免疫反应的影响，揭示了3次增强剂灭活疫苗通过诱导 “训练天然免疫”促进单核细胞的活化和成熟，从而发挥强有力抗病毒作用的分子机制。
质谱流式（CyTOF）的抗体由普罗亭提供、部分生信分析由普罗亭协助完成。
奥密克戎变种引起的新冠状病毒(COVID-19)持续大流行引发了公众对当前免疫策略有效性的担忧。即使接种了两或三剂疫苗，奥密克戎变种也会在个体中引发稳定的突破性感染。越来越多的报告表明，第三剂灭活疫苗能够通过抑制感染突破、症状发生和疾病严重程度在一定程度上发挥保护作用，但潜在的免疫机制在尚未确定。
▶ 研究思路
122 名奥密克戎感染者（其中29人没有接种过疫苗，40人接种了两剂，53人接种了三剂）
50名未感染者（其中16人没有接种过疫苗，15人接种了两剂，19人接种了三剂）
采用CyTOF和RNA-seq分析外周血单个核细胞(PBMC)，Olink分析血浆蛋白。
▶ CyTOF结果显示疫苗接种状态没有改变免疫细胞亚群的分布模式
与unvax-HC组相比，unvax-inf组CD8+ T细胞的频率降低，而与vax2-HC组相比，vax2-inf组CD4+ T细胞的频率增加，表明感染可能对CD8+ T和CD4+ T淋巴细胞产生相反的作用。B细胞和自然杀伤（NK）细胞的频率基本不变，而单核细胞和树突状细胞的频率在感染后似乎下降。因此，除了感染后中性粒细胞减少可以通过事先接种三次剂量疫苗来预防外，不同的疫苗接种史似乎并没有很大地改变急性感染期主要免疫细胞亚群的总体分布模式。
▶ CyTOF发现三次剂量的疫苗接种可能促进效应记忆CD4+的产生
对免疫细胞进行了41个表面标记物的深度分析，鉴定出45个亚群，并逐个亚群检查免疫细胞的改变。与vax2-inf或unvax-inf组相比，vax3-inf组中三个初始CD4+ T细胞亚群(T09-T11)的频率降低，而这些频率似乎在Omicron感染后增加，这表明三次剂量的疫苗接种可能有助于诱导感染后CD4+ T细胞活化。同样，感染后Treg及其T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白分子3 (TIM-3)的表达频率升高，而三次接种后这些趋势减弱。此外，除了三次接种外，CD161hi效应记忆CD4+ T细胞(T21)和CD27int效应记忆CD4+ T细胞(T26)的频率在感染后都有所下降，而且这种趋势在三次接种后部分逆转。结果表明，vax3-inf组T21的频率高于vax2-inf组，vax3-inf组T26的频率高于vax2-inf组和unvax-inf组。与vax2-inf或unvax-inf组相比，vax3-inf组T26中程序性细胞死亡受体1 (PD-1)的表达明显降低。这些结果表明，三次接种可能促进效应记忆CD4+的产生。
随后检测了9个CD8+ T细胞亚群，包括幼稚（T05）、幼稚样（T06）、干细胞样记忆CD8+ T细胞（T07）、效应记忆（T02、T16和T17）、效应（T04）、粘膜相关不变T细胞（T18）和未分类的CD8+ T细胞（T03）。除了在之前接种组中观察到的幼稚样CD8+ T细胞（T06）频率增加外，其他CD8+ T细胞或NKT细胞亚群没有因之前接种而显著改变。
▶ CyTOF发现三剂量疫苗可促进急性期单核细胞/树突细胞的激活和分化
1-4天的病毒感染主要是多种先天髓系的激活和功能细胞占主导地位的时期，6种髓系细胞可以分为三个类别，（1）前中性粒细胞(Pre-N, CD66bhi)，（2）经典单核细胞(M01和M02，CD14hiCD16lo）和非经典单核细胞s (NCMs) (M03, CD14loCD16hi)，（3）树突状细胞（cDCs、DC02、CD11Chi）和浆细胞样树突状细胞（pDCs、DC01、CD123hi）。与vax2-inf组和unvax-inf相比，vax3-inf组前中性粒细胞的比例更高。除了将M03标记为MCN外，人类白细胞抗原(HLA)-DR的差异表达将经典单核细胞分离为HLA- drint经典单核细胞(HLADRint-CMs, M01)和HLA- drhi经典单核细胞(HLA- drhi CMs, M02)。与奥密克戎感染启动先天免疫抑制的概念一致，与健康对照相比，感染奥密克戎的受试者倾向于显示HLA-DRint-CMs、HLA-DRhi-CMs或NCM的比例降低，尽管并非在所有三种疫苗接种条件下都如此。
为了探索疫苗接种和/或感染引发的先天性免疫细胞应答与CD4+ T细胞应答之间可能存在的深层关联，对所有亚群进行相关性分析，结果发现了两个高度负相关的细胞模块，其中一个模块由包含Treg和三个初始CD4+ T细胞亚群的子模块高表达，另一个模块由单核细胞和pDC亚群的高表达。Treg (T08)的频率与三个初始CD4+ T细胞簇(T09-T11)的频率呈正相关，从而形成了不同的CD4+ T细胞失活子模块，而HLA-DRhiCMs、NCM和pDCs之间也呈正相关，与CD4+ T细胞失活子模块呈强负相关，从而形成了先天免疫激活子模块。因此，在vax3-inf组中，单核细胞/树突状细胞的激活和分化与免疫抑制性Treg(阻断CD4+ T细胞激活)的扩增相反。
▶ RNA-seq证实三剂量疫苗接种使宿主在奥密克戎感染后通过单核细胞/树突状活化和致病性Treg扩增成熟
对同一队列的PBMA进行RNA-seq检测，确定了389个差异表达基因。基因集富集分析(GSEA)确定了许多排名靠前的分子途径，这些途径在免疫缺陷、病毒复制、单核细胞激活和分化、髓源性抑制细胞(MDSC)极化、DC激活、Treg功能稳定性、记忆T细胞激活、Th1/Th2分化、缺氧和线粒体代谢以及TNF和核因子kB (NF-kB)途径等类别中显著富集。随后，对这些具有关键免疫细胞组成的关键调控途径进行了分层聚类，HLA-DRhi-CMs (M02)和NCM (M03)的频率与病毒复制抑制、单核细胞和DC激活(而不是MDSC极化)和缺氧呈正相关，但与免疫缺陷和线粒体代谢呈负相关，Treg (T08)的频率与免疫缺陷和线粒体代谢呈正相关，但与单核细胞和DC激活、Treg功能稳定性和缺氧负相关。与unvax-inf组或vax2-inf组相比，vax3-inf组的功能稳定性Treg表达上调。此外，vax3-inf组单核细胞/巨噬细胞活化或分化基因以及pDC活化基因富集，线粒体的代谢基因、Treg增殖基因下调。单核/巨噬细胞活化基因与HLA-DRhi-CMs和NMC频率呈正相关，Treg增殖基因与Treg频率呈正相关，而Treg功能稳定基因表达与Treg频率负相关。因此，第三次加强疫苗接种可能通过单核细胞/树突状活化和成熟而不是致病性Treg增殖，从而使感染后的宿主受益。
▶ Olink发现疫苗接种/感染引起的血浆炎症因子改变平行于单核细胞活化和Treg扩增
血浆是PBMCs的一种系统微环境，由过多的炎症因子组成，它们标记和决定免疫细胞的状态。Olink蛋白质组学分析方法评估了整个队列中血浆中的180种独特的炎症和/或免疫蛋白。通过比较奥密克戎感染受试者与健康人的KEGG的前十条通路，发现与健康对照组相比，无论是否接种过疫苗，其单核细胞激活和分化的介质都有所升高。此外，某些炎症细胞因子可能参与对病毒的先天免疫反应或防御反应，特别是三种单核细胞激活相关细胞因子，细胞外新发现的晚期糖基化终产物结合蛋白受体(EN-RAGE)，肿瘤抑制素M (OSM)和转化生长因子(TGF-a)在感染后升高。与未接种组相比，三次接种组均显著升高，而两次接种组无显著升高，而促进免疫抑制M2巨噬细胞极化的趋化因子CX3CL1的水平在感染后除第三次加强组外均显著升高，且在vax3-inf组中均低于vax2-inf组或unvax-inf组。与vax2-inf组或unvax-inf组相比，vax3-inf组的共刺激分子TNFSF14 (LIGIT)在限制Treg积累、扩张和功能方面发挥了关键作用。EN-RAGE和OSM水平与两个单核细胞亚群(HLA-DRhi-CMs和NCM)的频率呈正相关，而TGF-a水平与NCM的频率呈正相关，三种单核活化相关因子均与Treg(T08)的频率呈负相关。TNFSF14与Treg、三个幼稚CD4+ T细胞亚群(T09、T10和T11)和分泌细胞因子的CD56hiCD16lo NK亚群(NK01)的频率呈负相关，但与两个单核细胞亚群(HLA-DRhi-CMs和ncm)、pDC (DC01)、CD56intCD16hi细胞毒性NK亚群(NK06)、两个效应记忆CD4+ T细胞亚群(T21和T26)和两个幼稚样T细胞亚群的频率呈正相关，从而暗示TNFSF14是连接这些关键疫苗接种和感染诱导免疫应答的血浆淋巴结因子。
CX3CL1水平与HLA-DRhi-CMs、ncm和一个初始CD4+ T细胞亚群(T09)的频率呈正相关，但与一个效应记忆 CD4+ T细胞亚群(T21)的频率呈负相关，它可能对T细胞激活发挥免疫抑制作用。对免疫亚群进行相关性分析发现，在先天免疫激活亚模块中，OSM、TNFSF14、WBC和中性粒细胞计数、EN-RAGE、M02、M03和DC01之间更密切相关，而参与单核细胞激活和成熟以及Treg功能的基因和通路，从而揭示了三剂疫苗的独特特征，即诱导单核细胞激活和分化，从而可能对奥密克戎攻击产生保护性免疫。
文章总结
该项研究首次系统性地描述了新冠病毒灭活疫苗接种对奥密克戎感染者免疫反应的影响，揭示了3次增强剂灭活疫苗通过诱导 促进单核细胞的活化和成熟，从而发挥强有力抗病毒作用的分子机制。这种系统性免疫评估对于指导未来的疫苗战略，以应对未来意外的COVID-19疫情和其他类似的公共卫生威胁至关重要。
上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授、上海血液学研究所诸江教授、呼吸与危重症医学科李庆云教授、转化医学国家重大科技基础设施（上海）陈赛娟院士为论文共同通讯作者。转化医学国家重大科技基础设施（上海）副研究员余山河，呼吸与危重症医学科主治医师林莹妮、副主任医师李勇；上海血液研究所博士研究生陈仕俊，呼吸与危重症医学科主治医师周丽娜、技师宋鹤杰为论文的共同第一作者。
参考文献：
Yu et al., 2023, Cell 186, 1–17
原文链接：
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