通过PBA技术研究皮肤光老化

Author： 许学文教授团队，四川大学华西医院烧伤整形外科；

                  周双白副主任团队，上海交通大学医学院附属第九人民医院   ；              

Journal:   Cell Communication and Signaling(2024) 22:594   (IF8.9)

Publication Time：2024年12月18日

DOI: 10.1186/s12964-024-01978-z

Background

光损伤是皮肤衰老的常见外在原因，UVB会促进活性氧（ROS）生成、诱导DNA损伤，导致皮肤出现多种问题。皮下脂肪组织（SAT）与皮肤结构紧密，临床观察显示富含SAT的区域皮肤质地更好，脂肪移植也对皮肤有益。虽然已知脂肪源性干细胞（ADSCs)和脂肪组织来源EVs(AT- EVs)对皮肤衰老和伤口愈合有治疗作用，但脂肪组织（AT）对皮肤的保护机制及是否由AT- EVs介导尚不明确，因此开展此项研究。

研究的创新性：采用新的腹股沟皮肤模型，明确AT对皮肤的保护作用；运用PBA分析AT- EVs和ADSC- EVs表面蛋白，发现CD151和APNEVs亚群的关键作用；磁珠法分离CD151阳性和阴性AT- EVs，证实CD151促进EVs被细胞摄取。

Methods

ResearchProgress

小鼠皮肤模型、脂肪移植模型构建

研究脂肪组织（AT）的存在是否可以减轻紫外线B（UVB）引起的光老化

建立AT模型：证明脂肪组织（AT）的存在可以减轻紫外线B（UVB）引起的光老化;

腹股沟皮肤模型l经过8周UVB照射实验，AT组皮肤弹性度显著高于对照组(Fig.1b).l组织学分析揭示：AT组表皮较薄，真皮较厚，胶原含量增加，衰老细胞较少。(Fig.1c).

这些研究结果表明，脂肪组织（AT）对防止光老化引起的皮肤衰老有显著的积极作用。

脂肪移植模型l在紫外线B（UVB）照射后（图1d），脂肪移植组中的移植脂肪仍然存活，皮肤看起来比对照组更光滑，皱纹也更少(Fig.1e)lCK-MPA10结果显示，脂肪移植组的黑色素水平降低，皮肤弹性得到改善。(Fig.1f, g). l组织学染色显示，脂肪移植组表现出表皮变薄、真皮增厚、胶原蛋白生成增加以及细胞衰老减少，这与腹股沟皮肤模型的结果一致。(Fig.1h). l光老化核心标志物分子实验分析（qRT-PCR，WB）显示：在脂肪移植组中Col1A1的表达上调，而MMP9和CDKN1A的表达下调，再次证明了脂肪移植组胶原含量增加、胶原降解能力降低以及衰老细胞减少。Fig.1i‒k).

这些发现进一步支持了以下结论：脂肪组织（AT）的存在显著减轻了紫外线B（UVB）诱导的光老化，从而使衰老皮肤恢复年轻。

裸鼠EVs注射实验

进一步研究AT-EVs是否是AT发挥其保护作用的机制

Methods:

EVs表征：electronmicroscopy ,flow NanoAnalyzer、WB

皮肤光老化程度评估：

皱纹数量对比；

CK-MPA10:皮肤弹性与黑色素含量检测；

组织学分析：HE,Masson, Sirius Red, and SA-β-gal staining、situdihydroethidiumred fluorescence staining

分子实验分析：qRT‒PCRand WB（光老化核心标志物：Col1A1、MMP9 a、 CDKN1A）

裸鼠EVs注射实验

进一步研究AT-EVs是否是AT发挥其保护作用的机制

l经过8周UVB照射实验，AT-EV处理的皮肤显示出皱纹数量的减少(Fig.2c).lCK-MPA10:AT-EV组黑色素含量与皮肤弹性明显改善(Fig.2d, e).l组织学分析显示：与UVB组相比，AT-EV组的表皮较薄，真皮较厚，胶原水平增加，衰老细胞较少，ROS水平较低(Fig.2f-k).lAT-EVs调节皮肤基因表达，增加Col1A1的表达并减少MMP9和CDKN1A的表达。(Fig. 2l-n).

实验结果显示，AT-EV组和ADSC-EV组之间没有显著差异，效果相似，这表明AT通过AT-EVs发挥其保护作用。

体外细胞实验

研究AT-EVs对UVB暴露的成纤维细胞的影响

Methods:

细胞种类：NIH3T3和人成纤维细胞

组织学分析：SA-β-gal staining

分子实验：qRT‒PCRand WB（光老化核心标志物Col1A1、MMP9 a、 CDKN1A）

ROS 定量：DCFH2-DA

细胞增殖实验：CCK-8analysis of NIH3T3

体外细胞实验

研究AT-EVs对UVB暴露的成纤维细胞的影响

研究成纤维细胞的目的：在于探讨其在皮肤光老化过程中的作用及其与AT-EVs之间的相互作用；

成纤维细胞是皮肤真皮层的主要细胞类型，负责合成和维持细胞外基质（ECM），尤其是胶原蛋白和弹性纤维。这些成分对于保持皮肤的弹性和紧致性至关重要。随着年龄的增长和紫外线（UVB）辐射的暴露，成纤维细胞的功能会受到影响，导致胶原蛋白降解和弹性纤维破坏，进而引发皮肤光老化。

l分子实验显示：AT-EVs增加了NIH3T3细胞中Col1A1的水平，同时减少了MMP9和CDKN1A的水平(Fig.3b‒d). l经AT-EVs处理的人类成纤维细胞表现出较少的衰老现象，这通过较少的SA-β-gal阳性细胞（图3c, d）得以体现，并且通过DCFH2-DA测量显示ROS积累减少。(Fig. 3g, h).l细胞增殖实验：AT-EVs在紫外线B（UVB）照射后24小时内比ADSC-EVs更快地促进NIH3T3细胞的增殖，这表明AT-EVs可能被细胞更快地吸收，从而更有效地发挥其作用。(Fig.3i).

单囊泡蛋白组分析PBA（260panel）

探究AT-EVs比ADSC-EVs更快被细胞吸收的原因

单囊泡蛋白组分析PBA（260panel）

探究AT-EVs比ADSC-EVs更快被细胞吸收的原因

l FlowNanoAnalyzer：在10毫升的脂肪组织中，AT-EVs的数量约为6.1 × 10¹¹，大约是ADSC-EVs数量的200倍(Fig.4c)。l主成分分析PCA显示：ADSC-EVs和AT-EVs的蛋白表达模式存在差异(Fig.4d)l热图突出了前100种差异表达的表面蛋白，特别显示了AT-EVs中CD151和AdipoQ的表达水平显著更高(Fig.4e)l   t-SNE降维分析结合FlowSOM算法将EVs划分为14个聚类(Fig. 4f), 并通过颜色编码显示其来源组别及亚群间差异(Fig.4g)l与ADSC-EVs相比，AT-EVs表现出更丰富的表面蛋白多样性.(Fig.4i)l表面蛋白表达分析表明，AT-EVs中AdipoQ和CD151的表达水平显著高于ADSC-EVs(Fig. 4j).

这些发现揭示了AT-EVs具有更高的亚群多样性，以及CD151和AdipoQ等关键蛋白的更高表达水平，这可能是其更高效细胞摄取能力和UVB暴露下更强保护作用的原因。

AdipoR基因敲除实验

AT-EVs表面的脂联素激活AMPK通路以减轻光老化

l WB分析显示，在NIH3T3-shAdipoR组中，AdipoR的表达显著降低(Fig. 5d, e)，表明基因敲除有效；l预先用AT-EVs处理可以缓解UVB诱导的p-AMPKT172减少(Fig. 5f, g).l WB分析表明，AT-EVs和ADSC-EVs都倾向于抑制p-NF-κB p65 S536水平的增加(Fig. 5f, g)liNOS是NF-κB通路的下游分子，在shNC-AT-EV组中的表达低于shAdipoR-AT-EV组(Fig. 5f, g).lγ-H2AX的免疫荧光分析显示，在shNC-AT-EV组中核DNA损伤减少(Fig. 5h, i).

这些结果表明，AT-EVs上的APN可以激活AdipoR，刺激AMPK通路，抑制NF-κB通路，减少UVB诱导的DNA损伤，并保护细胞免受UVB照射.

体外细胞摄取与细胞免疫荧光实验

研究细胞摄取EV快慢是否与CD151有关

Method: 磁珠法分选CD151+ EVs cluster

                    体外细胞摄取与细胞免疫荧光实验实验

l PBA和WB分析证实，AT-EVs上的CD151表达量高于ADSC-EVs(Fig. 6a). l用400 μg/mlPKH26标记的ADSC-EVs或AT-EVs处理NIH3T3细胞30分钟后，AT-EV组细胞内红色荧光多于ADSC-EVs组(Fig. 6b, c), 表明AT-EVs的细胞摄取速度更快. 此外，AT-EV组的NIH3T3细胞表达了更多的CD151(Fig. 6b, d).l时间推移摄取记录显示，AT-EVs比ADSC-EVs更早被内化. l为了研究AT-EVs上CD151的表达是否促进比ADSC-EVs更快的细胞摄取，研究人员通过磁珠从CD151阴性的AT-EVs中分离出CD151阳性的AT-EVs(Fig. 6e).l WB分析证实了分选过程的有效性(Fig. 6f)l用CD151阳性的AT-EVs处理的细胞显示出增强的红色荧光，表明EVs的摄取速度更快   (Fig. 6g, h), 以及CD151表达升高(Fig.6g, i).

这些发现表明，CD151能够促进细胞对EVs的内吞作用。

研究结论：皮下脂肪组织（AT）通过脂肪组织源性细胞外囊泡（AT-EVs）保护皮肤免受光损伤。AT-EVs组成多样，包含14个亚群，且CD151和APN的表达水平高于脂肪源性干细胞源性细胞外囊泡（ADSC-EVs）。CD151促进AT-EVs的快速内化，而APN激活AMPK通路并抑制NF-κB通路，降低成纤维细胞中的ROS水平，从而保护细胞免受UVB辐射的伤害。AT-EVs产量高且易于快速获取，突显了其在临床应用的潜力。