高IF的植物线粒体文章是怎样炼成的

首先是选题的确立： 细胞质雄性不育（CMS）是国际制种业进行商品化杂交制种的趋势性技术，利用CMS培养的不育系进行杂交制种，可以节省大量的人力物力，并提高杂交种子的纯度，提升农作物产量。抓住了这样的核心问题，去寻找CMS的相关候选基因，为制种业提供理论支持，自然选题的意义也确立起来。

确立了研究主题，就要选择适宜的技术手段：CMS是由线粒体基因控制的，那么一个优质的植物线粒体基因组研究就非常有必要了。本研究中，对辣椒上海圆的雄性不育系138A及保持系138B进行了全线粒体基因组测序。

无疑，全线粒体基因组测序解决了不育系138A及其保持系138B的mtDNA概况描述问题。通过NGS测序结合Pacbio测序技术，最终获得不育系及保持系的mtDNA信息：

并成功获得不育系138A和保持系138B的线粒体基因组圈儿图：

之后要处理的就是线粒体基因组的ORF预测和基因注释的问题：在进行ORF信息的提取后，在138A及138B株系中发现了已知基因间的一对一关系，并且注释出了包括编码核糖体蛋白大亚基、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、ATP合成酶，细胞色素B及细胞色素C相关蛋白的基因等（上图A，B）。

做完了上海圆不育系和保持系的线粒体基因组背景调查，下一步研究者考量的就是祖源和差异性的问题：

1.来自中国的株系与国外的株系间存在祖源关系吗？ 他们之间的分离又是从何时开始的？

2.不育系和对应的保持系之间，在线粒体基因组上的差异在哪儿呢？ 这些差异是否就是形成不育系的决定性因素？

3.得到mtDNA上序列和结构的差异，是否可以从中获得造成不育的关键的候选基因，这些基因又是否适用于未来的株系改造呢？

带着这些问题，研究者挑选了来自韩国的不育系FS4401和对应的保持系Jeju，开展了全线粒体基因组的比较研究。

在已知的基因中，中国上海圆品系与韩国品系相比，缺少三个基因（atp4, atp8, mmtB）;此外，中国上海圆株系间发现了23个独有区域（其中138A有11个，138B有12个），而与之相比，韩国与中国的不育系之间及保持系之间反倒呈现出高度一致和谐景象（下图）~~

为查明基因组的结构变异，研究以138B为参考基因组将138A和138B进行了SV的研究——研究中发现了13个异位区，3个反转区和8个异位反转区（如下图），同时发现的还有两个插入和一个缺失区域，大小均超过50bp。

通过SNP和InDel检测分析，在两个基因组中共发现112个SNP和14个InDel。在这些突变中只有一个非同义突变的matR为已知线粒体基因，因此它与不育系性状无关。另有7个SNP造成138A及138B共有的6个ORF上的非同义突变，但未检出这些ORF有嵌合结构。此外，二者共有基因的两个InDel也并导致移码突变。

折腾了这么久，还是没有筛选初与CMS相关的候选基因~ 它到底在哪儿呢？我们能否一探究竟找到这些信息呢？研究者开展了以下：

• 在不育系特有的基因区域寻找新的ORF；

• 分析嵌合结构，共转录事件和跨膜结构域；

基于上述两种思路进行CMS候选基因分析：研究者找到138A特有ORF上orf292a基因上的一处嵌合结构，包含有rpl2的外显子和一段3’端的未知序列（下图G）；此外，还发现orf300和临近sdh3发生的共转录事件（下图F）；以及各类跨膜结构域（orf157a, orf314a, orf262a, orf300a, orf115b）等（下图A-E）.

研究中还对上述信息进行了RT-PCR的验证，如下图：

经过验证后筛选出的四个候选基因同时在138A和138B两个株系中进行了表达模式的研究（real-time PCR，下图）,发现这四个基因在辣椒的保持系138B中表达量均非常低。如此一来，这几个基因的高表达就很可能就是我们要寻找的不育系性状相关基因。

研究的最后，进行了CMS marker的开发和验证：orf300a和orf314a被认为是CMS的强候选基因。Orf300a成为CMS特性的新marker。

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