ChIP-seq技术介绍

一、技术介绍

染色质是真核生物基因组DNA主要存在形式，对蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用的研究可以阐明真核生物基因表达调控机制。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitaion, ChIP）是用来研究细胞内特定基因组区域特定位点与结合蛋白相互作用的技术，可用于DNA与多种蛋白的互作研究。

ChIP-Seq是指将ChIP与新一代测序技术相结合，可在全基因组范围内分析蛋白结合位点。用于在全基因组范围中研究DNA结合蛋白（相互反应）、组蛋白修饰（表观遗传标记）和核小体的技术，研究这三个主题可有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构。

ChIP-Seq实验原理：在生理状态下，把细胞内的DNA与蛋白质交联（Crosslink）后裂解细胞，分离染色体，通过超声或酶处理将染色质随机切割，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，再通过反交联（Reverse crosslink）释放结合蛋白的DNA片段，最后测序获得DNA片段的序列。

图1. ChIP-seq实验原理

ChIP-Seq研究应用：转录因子结合位点（transcription factor binding sites，TFBS）、组蛋白修饰（histone modification），并且可以对多个样品进行差异比较。组蛋白方面，研究人员可通过ChIP-Seq探究组蛋白的甲基化、乙酰化、泛素化修饰对其结合DNA的影响。在转录因子方面，可通过分析转录因子结合序列的特征发现其经典作用基序或协同作用因子，也可通过分析这些转录因子在基因组上的位置分布情况来拓展其基因调控作用。转录因子通常分布在基因启动子区和增强子区，通过ChIP-Seq检测特定转录因子分布情况，可能发现新的靶基因或调控机制。此外，通过比较转录因子在不同阶段或不同状态的样本中靶点的差异，还可分析该转录因子的作用差异。

ChIP-seq提供了一种高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究蛋白质-DNA互作手段，可应用到所有基因组序列已知的物种，可研究任何一种DNA相关蛋白与其靶定DNA之间的相互作用，并能确切得到每一个片段的序列信息。而ChIP-seq与HiC、ATAC-seq、RNA-seq的联合研究可以对基因转录调控作用进行详尽的分析。ChIP-seq正逐步成为研究基因调控和表观遗传机制的热点手段，具有很好的应用前景。

图2. ChIP-seq与其他技术的区别

ChIP-Seq的优势：

1、具有碱基层面的分辨率；

2、不会有ChIP-chip中由DNA片段杂交导致的噪音；

3、ChIP-chip中的微阵列信号不是线性增长的，其所测量的范围有限。

4、由于在设计array时，探针的数量、种类有限，当coverage比较高的时候无法准确测量，也无法发现新的序列。

二、实验仪器

细胞培养箱、细胞超声破碎仪、高速冷冻离心机、恒温振荡器、PCR仪、

核酸电泳仪、静音混匀器、真空干燥箱、真空泵、q-PCR仪等。

三、实验试剂

甲醛（终浓度1%）、甘氨酸（2M）、蛋白酶抑制剂、蔗糖、氯化锂、TritonX-100、脱氧胆酸钠盐、CA-630、SDS、NaCl、CH3COONa、NaOH、NaHCO3。

四、实验Buffer

抽提缓冲液、ChIP稀释缓冲液、洗脱缓冲液、溶液缓冲液等

五、实验步骤

1．取样。快速称取新鲜组织样品2-4g，并用剪刀将其剪碎；

2．交联。将剪碎的材料浸没在含有甲醛交联缓冲液的50ml离心管中，抽真空处理15-30min；

3．终止交联。加入2.5ml甘氨酸（2M），混匀，抽真空5min。取出样品，并洗涤3至5次，吸干样品表面水分，-80℃保存或继续操作；

（以下步骤均需要在冰上操作，且实验试剂以及仪器用品需要预冷处理）

4．液氮研磨样品至粉末状。取相同量的样品与50ml离心管中，加入30ml抽提Buffer I，冰上放置30min，期间可将样品摇匀，与抽提Buffer充分反应；

5．在冰上，用双层Miracloth滤布过滤至新的50ml管中。在4℃，6000rpm离心20min，弃上清；

6．加入1ml抽提Buffer II，重新悬浮沉淀并转移到新的1.5ml离心管中。4℃，12000rpm，离心5min，弃上清；

7．加入500μL抽提Buffer III重新悬浮，并取一新的1.5ml离心管加入等体积的抽提Buffer III，并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的1.5ml离心管的上层，4℃，13000rpm，离心1h，弃上清；

8．加入400μL核酸裂解缓冲液，混匀，置冰上裂解30min；

9．超声打断。打断前，每个样品取20μL于新的离心管中保存。采用Bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断，对打断后的样品进行解交联纯化及琼脂糖凝胶电泳检测；

10．用ChIP稀释缓冲液，洗涤protein A/G beads。在1.5ml离心管中加入1ml ChIP稀释缓冲液和30μL protein beads（加之前要充分混匀），并在静音混匀器上混匀5min，磁力架上静置2min，待上清澄清后弃上清；

11．加入995μL ChIP稀释缓冲液以及5μL的抗体，在4℃，静音混匀器上混匀4-12h后，在磁力架上放置5min，待上清澄清后弃上清；

12．用ChIP稀释缓冲液清洗磁珠，再加入900μL ChIP稀释缓冲液及100μL离心好的染色质上清液，在4℃，静音混匀器上混匀7-12h；

13．将上述处理后的样品（含有抗体-蛋白质-DNA复合体）放置在磁力架上处理5min，弃上清。用1ml washing Buffer在4℃环境下，混匀5min，并放置在磁力架上静置2min，弃上清；

14．加入500μL Elution buffer，65℃，800rpm，震荡洗脱20min后，在磁力架上放置5min，吸上清于一新的离心管中，并做好标记；

15．加入20μL 5M Nacl，65℃，600rpm，过夜解交联；取20μLInput产物加入500μL Elution buffer和20μL 5M NaCl同时解交联；

16．在解交联后的产物中加入10μL 0.5M EDTA，5μL RNase，20μL Tris-Hcl（pH 7.0），2μL蛋白酶K，45℃处理1h；

17．利用DNA纯化试剂盒纯化步骤16的产物，加15-20μL ddH2O，检测浓度及纯度，-80℃保存。

六、实验试剂配制

甘氨酸（2M）配制方法（以100ml为例）：

甘氨酸的摩尔量为0.1*2=0.2mol；

甘氨酸的相对分子质量为75.07g/mol；

所以需要称量的甘氨酸的质量为75.07*0.2=15.014g；

即称取15.014g甘氨酸，用水溶解后，用100ml容量瓶定容到100ml。

七、DNA样本质量检测

² 1％的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质；

² NanoDrop2000微量分光光度计检测样品纯度；

² Qubit®2.0荧光定量仪检测DNA样品浓度；

² Agilent2100 Bioanalyzer检测目的峰。

质量检测合格样品参数、峰图及胶图示例如下：

图3. Agilent 2100 Bioanalyzer检测结果图（合格）

质量检测不合格样品参数、峰图及胶图示例如下：

图4. Agilent 2100 Bioanalyzer检测结果图（不合格）

八、ChIP-Seq文库制备

通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，10ng免疫共沉淀后的DNA起始，依次末端修复、加“A”、加PE Adapter反应和PCR扩增，最后进行片段筛选获得Chip文库。本操作流程主要包括以下几个内容：

1）Fragment DNA（DNA片段化）；

备注：若DNA检测结果在100-500bp范围内，不进行此步骤；若片段不在100-500bp范围内，通过超声打断至100-500bp。

2）End Repair（末端修复）；

3）A-Tailing（末端加“A”）；

4）Ligate PE Adapter（PE接头连接）；

5）PCR扩增Chip文库；

6）2%琼脂糖片段筛选，切胶回收获得ChIP最终文库。

图5. Chip-Seq文库构建流程图

文库构建完成后，先使用Qubit® 2.0荧光定量仪进行初步定量，随后使用Aglient2100 Bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用StepOnePlusTMReal-Time PCR system进行Q-PCR检测，对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞10nM），以保证文库质量。

九、测序

检测质量合格的文库，在Illumina HiSeq平台进行测序。

十、信息分析

1）过滤及比对

a）原始数据

b）数据过滤

c）数据质量值分布

d）数据碱基分布

e）比对分析

f）比对质量

g）相关性分析

h）Reads分布