通过全基因组分析发现FHL1是急性髓样白血病有效的预后和潜在的治疗标志物

Genome-wide Identification of FHL1 as a Powerful Prognostic Candidate and Potential Therapeutic Targ5.736EBioMedicine . 2020 Feb;52:102664. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102664. Epub 2020 Feb 12.

Abstract

Background: Acute myeloid leukaemia (AML) is a malignant haematological tumour with high heterogeneity and mortality. A reliable prognostic assessment is critical for treatment strategies. However, the current prognostic evaluation system of AML is insufficient. Methods: Genome-wide univariate Cox regression analysis was performed on three independent AML datasets to screen for the prognostic-related genes. Kaplan-Meier survival analysis was employed to verify the efficacy of FHL1 in evaluating overall survival in 1298 de novo AML patients, 648 non-acute promyelocytic leukaemia AML patients and 407 cytogenetically normal AML patients; the data for some of these patients were also used for EFS and RFS validation. Multivariate Cox regression was performed to validate FHL1 as an independent prognostic indicator. WGCNA, GSEA, and gene correlation analysis were applied to explore the mechanism of FHL1 in AML. The synergistic cytocidal effect of FHL1 knockdown was verified in in vitro experiments. Findings: Comprehensive genome-wide analyses and large-sample validation showed that FHL1 is a powerful prognostic candidate for overall survival, event-free survival, and relapse-free survival in AML and is independent of prognosis-related clinical factors and genetic abnormalities. The molecular mechanism may occur through regulation of FHL1 in leukaemia stem cells, tumour-associated signalling pathways, and transmembrane transport of chemotherapeutic drugs. FHL1-targeted intervention enhances the sensitivity of AML cells to cytarabine. Interpretation: FHL1 may serve as an evaluation factor for clinical strategy selection, and its targeted intervention may be beneficial for chemotherapy in AML patients.

Keywords: Acute myeloid leukaemia; Cytarabine; FHL1; Prognosis; WGCNA.

1 摘要：

背景：急性髓系白血病(AML)是一种异质性高、死亡率高的恶性血液肿瘤。可靠的预后评估对治疗策略至关重要。然而，目前的急性髓细胞白血病的预后评估系统还有所欠缺。

方法：对三个独立AML数据集进行全基因组单变量Cox回归分析，以筛选预后相关基因。采用Kaplan-Meier生存分析，通过1298例新生AML患者、648例非急性早幼粒细胞白血病AML患者和407例细胞遗传学正常AML患者验证FHL1基因评估总体生存的有效性;其中一些患者的数据也用于EFS和RFS验证。多变量Cox回归验证FHL1作为独立预后的标志物。应用WGCNA、GSEA及基因相关分析探讨FHL1在AML中的作用机制。

结论：全面的全基因组分析和大样本验证表明，FHL1是AML患者总体生存、无事件生存和无复发生存的强有力的预后候选，且独立于与预后相关的临床因素和遗传异常。其分子机制可能通过调节白血病干细胞中的FHL1、肿瘤相关信号通路和化疗药物的跨膜转运而发生。靶向FHL1干预可增强AML细胞对阿糖胞苷的敏感性。FHL1可作为临床策略选择的评价因子，其靶向干预可能有利于AML患者的化疗。

2 材料和方法：

2.1 患者与治疗方法：

一个数据集来自癌症基因组图谱(TCGA)，该图谱提供了151名AML患者，TCGA提供了AML患者的主要形态学和细胞遗传学亚型，以及基于高通量测序(RNA- seq)的RNA表达谱和详细的临床信息。所有基因表达数据均可通过数据门户获取（https://portal.gdc.cancer.gov/）。TCGA研究网络对AML患者的临床特点、细胞遗传学和分子生物学信息、治疗方法和生存状态进行了总结。

另外两个数据集分别从德国AML合作组织(AMLCG)和包括162和78名未经治疗的CN-AML患者（不包括MDS-RAEB）。所有患者均接受化疗。从Gene Expression Omnibus(GEO， accession number: GSE12417) 获得临床和生存信息以及微阵列数据。

其他一些已发布的AML数据集也用于进一步分析，GSE37642-GPL96 (n = 417)、GSE37642-GPL570 (n = 136)、GSE106291 (n = 250)用于所有新生或non-APL AML患者的生存分析; GSE71014（n = 104）用于CN-AML患者的生存分析；GSE83533（n = 19）用于复发性AML病例分析；GSE30029 (n = 121)研究干细胞的基因表达模式。上述所有表达信息及临床资料均可在GEO数据库中公开获取;省略临床资料不完整的病例。

为了进一步验证，我们收集了来自中国山东大学齐鲁医院血液科知情同意的28例新诊断AML患者的骨髓样本；其中15例对后续标准化疗方案敏感，13例耐药。本研究经山东大学医学院医学伦理委员会批准。获得患者知情同意。

2.2 变量Cox回归分析

为了确定预后基因，以TCGA数据集为训练集，进行全基因组单变量Cox总生存期(OS)回归分析。以FDR<0.05为统计界限，获得预后候选基因。通过单变量Cox回归在代表CN-AML患者的两个AMLCG数据集中验证了候选基因，以鉴定潜在的预后指标。以各基因在个体群体中的中位表达水平为截止值，将基因表达水平一分为二。

2.3 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

WGCNA是一种系统的生物学方法，用于描述不同样本之间的基因相关性模式。基因组和表型之间的关联有助于确定候选生物标记基因或治疗靶点。在这项研究中，构建了TCGA数据的基因表达矩阵，并选择了25％变异最大的基因作为输入数据。使用R软件中的“ WGCNA”软件包执行WGCNA，并构造邻接矩阵和拓扑重叠矩阵（TOM）并计算相应的不相似度（1-TOM）。用动态树切割法进行基因树状图的构建和模块鉴定，并计算模块特征基因与生存条件之间的相关性。进一步分析含有FHL1的模块进行基因表达和功能富集分析。

2.4 基因特征分析

采用基因富集分析方法(GSEA， http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)对FHL1相关的生物学功能进行了分析。对TCGA中FHL1高(上四分位数)和低(下四分位数)表达的样本进行GSEA检测。GSEA的临界值为P <0·05和错误发现率（FDR）<0·25。

2.5 细胞培养和慢病毒转导

AML细胞系Kasumi-3，U937和Kasumi-1从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得，在RPMI 1640培养基(Life Technologies， Carlsbad， CA)中培养，加入10%胎牛血清(Gibco， Carlsbad， CA)，并在37℃，5% CO2的环境中培养。Kasumi-3和U937细胞分别用针对FHL1表达短发夹rna (shRNAs)的慢病毒或从GenePharma(上海，中国)获得的混乱序列转导，以比较FHL1敲除的生物学效应。用嘌呤霉素筛选阳性细胞进行病毒感染。针对FHL1的干扰序列为sh-FHL1-1’-GGACTTCTACTGCGTGACTTG-3’和sh-FHL1-2 - 5’-GCTGTGGAGGACCAGTATTAC-3’。

2.6 质粒转染

按照制造商的规程，用罗氏转染试剂（瑞士罗氏）将3Flag标记的FHL1真核表达质粒及其载体（Genechem，中国上海）转染到Kasumi-1和U937细胞中。

2.7 阿糖胞苷（cytarabine）治疗和测量细胞活力

阿糖胞苷购自Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解并冷冻至- 20℃。在100 nM或500 nM浓度下用阿糖胞苷处理AML细胞。采用细胞计数Kit-8 (CCK-8)检测细胞活力。按照每个孔8×10 ³个细胞分配到96孔板中，每个孔中含100 µL不同浓度阿糖胞苷完全培养基，持续72 h，然后将10 µL CCK-8试剂添加到每个孔中并孵育3 h在孵化器中。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，并计算细胞活力。

2.8 RNA提取和实时定量PCR（qRT-PCR）

用Trizol法提取细胞和临床样本中的总RNA。利用带有gDNAEraser的PrimeScript™RT试剂试剂盒合成互补DNA (cDNA)。通过PCR，使用β-肌动蛋白作为对照验证FHL1基因的表达。FHL1正向5'-CCAACACCTGTGTGGAATG-3'和反向5'-GAGTCCTCCCGAGTGGTG-3'；β-肌动蛋白正向5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'和反向5'-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'。

2.9 统计分析

根据FHL1high或FHL1low的表达值(与患者所属队列的中位数相比)，将FHL1的表达一分为二。总生存期(OS)被定义为从最初诊断到因任何原因死亡或观察结束的时间。无事件生存期(EFS)包括从最初诊断到复发或死亡的间隔时间。采用log-rank检验计算OS、EFS和无复发生存(RFS)的概率。

多变量Cox回归模型包含多个预测变量,包括年龄、白细胞(WBC)计数,不良细胞遗传学风险和基因突变。C-index由R软件的“survcomp”包计算，C-index使用“cindex.comp”包进行比较。利用R软件的“survcomp”和“survival”软件包进行时间相关的接收机工作特性(ROC)分析和曲线下面积(AUC)计算。曲线下综合面积的比较采用“iauc.comp”软件包。两组之间的分析是使用Student t检验，Welch t检验，配对t检验或Mann-Whitney检验进行的，基因表达与临床特征之间的关系通过Mann-Whitney检验，卡方检验或费舍尔的精确测试。使用R 3.5.3，Stata / IC 15.0和GraphPad Prism 8.0.2软件完成基因表达相关性分析和所有统计。每个实验重复三次，所有数据以均数±标准差表示。所有检验的显著性水平为p-value <0·05。

3 结果分析

3.1 整合基因组筛选急性髓系白血病新的预后标志物。

为了获得稳定的AML预后和靶向干预的相关基因，我们合成了AML患者的基因表达数据和生存状态，并进行了全基因组单变量Cox回归分析，在CGA-LAML和两个CN-AML数据集：AMLCG（1999-2003）和AMLCG（2004）中获取与预后相关的基因。首先，我们确定了存在于所有三个独立数据集中的12311个基因。然后以TCGA数据集作为训练集，将上述基因按中位基因表达水平分为两组，再进行单变量Cox回归。以FDR<0.05为统计界限，共获得394个候选基因。候选基因分别在AMLCG(1999-2003)和AMLCG(2004)中进行单变量Cox回归验证。最后，在两个验证数据集中验证了FHL1、HOPX和FAM124B三个基因，并在预后评估中进一步评估（图1）。

图 1

为了比较这三个基因的预后评估能力，我们对FHL1、HOPX和FAM124B进行了AML患者生存的多因素Cox回归分析。结果显示，Cox模型中三个基因均具有统计学意义，其中FHL1表现出较大的危险比(Hazard Ratio, HR)，可能在模型中发挥重要作用（图2）。然后我们计算这三个基因生存评估的c指数。结果表明，FHL1的c指数为0·762(0·683-0·842)，HOPX为0·690(0·601-0·779)，FAM124B为0.652(0·558-0·746)。FHL1的c指数高于FAM124B (Student’s t-test;P= = 0·02)，略高于HOPX，但无统计学意义(Student’s t-test;P = = 0·089)。对3个基因进行时间依赖的受试者工作特征(ROC)分析，结果显示FHL1曲线下面积(AUC)较大，尤其是10年生存率。曲线下综合面积(IAUC)统计分析表明，FHL1曲线下综合面积(AUC)高于HOPX曲线下综合面积(Wilcoxon秩和检验;P= = 0·011)和FAM124B (Wilcoxon秩和检验;P < 0·0001)。考虑到APL在AML中的特异性，我们还对非APL AML患者的FHL1、HOPX和FAM124B进行了生存评估分析。结合单变量Cox回归结果、多变量Cox回归结果和时间依赖ROC结果，我们发现FHL1在非APL AML患者中也具有更好的生存评估表现(图2)。综上所述，FHL1在三个筛选基因中对AML具有较好的预后评估效能，但其在白血病中的作用尚不明确，因此我们选择了FHL1进行进一步的研究。

图 2

3.2 FHL1的高表达是预测初发AML患者不良临床结果的重要因素

本研究共对1298例初发急性髓系白血病的成年患者进行了多项临床试验，以评估FHL1的预后价值。其中，在四个独立数据集中，FHL1表达较高的初发AML患者总OS较FHL1表达较低的患者短(GSE37642-GPL96 (median OS 8·7 vs. 16·4 months; log-rank test, P = 0·011), GSE37642-GPL570 (median OS 11·4 vs. 24·1 months; log-rank test, P = 0·016), TCGA (median OS 8·1 vs. 46·5 months; log-rank test, P<0·0001) and GSE106291 (median OS 15·1 vs. 28·8 months; log-rank test, P = 0·04)) (图3.a)。

图 3

同样，在非APL组中，FHL1高表达也提示AML患者生存期较短，预后较差(图3.b)。对FHL1的预后价值，我们也对FHL1在中间细胞的表达进行了风险类别评估，在407名核型正常的新生AML患者(包括TCGA CN-AML患者)中发现了高FHL1表达暗示较差的预后(median OS 10·7 vs. 25·3 months; log-rank test, P = 0·021), GSE71014 (median OS 25·0 months vs. undefined; log-rank test, P = 0·029) datasets, AMLCG (1999-2003) (median OS 7·9 vs. 33·3 months; log-rank test, P <0·0001) and AMLCG (2004) (median OS 11·4 months vs. undefined; log-rank test, P = 0·0024)（图4.c）。此外，与FHL1低的患者相比，FHL1高的患者EFS更糟(median OS 6·4 vs. 17·0 months; log-rank test, P <0·0001) and RFS (median OS 13·4 vs. 34·1 months; log-rank test, P = 0·005)，同时在CN-AML患者 (EFS median OS 7·5 vs. 14·8 months, log-rank test, P = 0·0045; RFS median OS 8·3 vs. 17·0 months, log-rank test, P = 0·025) 和非APL AML患者的EFS (EFS median OS 7·2 vs. 12·95 months, log-rank test, P = 0·0018; RFS median OS 14·9 vs. 17·0 months, log-rank test, P = 0·23)，也观察到同样的现象，但RFS并没有这个现象（图4.d-f）。

图 4

此外，与预后预测一致，FHL1高表达患者的细胞遗传学和分子风险分类较差。因此，FHL1是新生AML患者的有效预后因素。

3.3 FHL1是AML不良预后的独立预测因子

多个临床因素对AML预后有显著影响，以年龄、白细胞(WBC)计数和细胞遗传风险为代表。此外，许多基因突变对AML的预后也有重要的指示作用。单变量Cox回归用于具有较高突变频率的基因，以选择与预后相关的突变基因。对于初发AML患者，对年龄、WBC计数、不良细胞遗传学风险以及TCGA中初发AML患者的MLL-PTD、FLT3、DNMT3A、TP53和RUNX1突变等几个对OS有显著影响的参数进行了多变量分析。对AML患者，多因素分析结合所有预后因素时，高FHL1表达仍是OS(HR = 2·194; 95% confidence interval (CI), 1·409-3·416; P = 0·001)、EFS (HR = 2·025; 95% CI, 1·326-3·093; P = 0·001)、RFS(HR = 2·240; 95% CI, 1·300-3·859; P = 0·004)的独立不良预后因素（图5）。

图 5

在非APL AML患者中，高FHL1表达仍然是OS的独立不良预后因素。在CN-AML亚型中，FHL1的高表达也与OS相关

当与所有这些预后因素结合进行多因素分析时，FHL1的高表达仍然是OS(HR = 2·143; 95% CI, 1·134–4·050; P = 0·019), EFS (HR = 2·498; 95% CI, 1·355–4·604; P = 0·003)和RFS(HR = 2·504; 95% CI, 1·235–5·078; P = 0·011)独立于年龄、白细胞计数、MLL-PTD、FLT3和DNMT3A突变不良预后因素（图6）。

图 6

3.4 FHL1与其他已发表的预测基因集在预后评估方面的比较

已报道了几种基于基因表达的全基因组AML预后基因集。为了比较FHL1和其他预后模型的预后价值，我们对FHL1和3基因、7基因和24基因模型进行了两两配对的多变量Cox回归。多因素Cox回归分析显示，大多数比较中OS(8/9)、EFS(3/3)和RFS(2/3)的FHL1仍然是独立且有统计学意义(P <0·05)的(表1)，而OS(3/3)和EFS(3/3)在非APL组中。这些结果表明FHL1是一种有效、独立、简单的AML预后指标。

表 1

3.5 FHL1的表达与AML的多种临床和分子特征有关

根据FHL1中位表达水平将TCGA中AML患者分为两组。FHL1的高表达与年龄的增长和复杂的细胞遗传学有关。此外，FHL1 - 高和- 低组透露，French-American-British（FAB）分类的不同分布特征。M0多见FHL1表达增高，M3多见FHL1表达降低。我们分析TCGA中突变频率较高的基因，发现FHL1表达较高的患者RUNX1中突变的发生率较高，但那些FHL1表达较低的患者，其NPM1和CEBPA等临床预后较好的基因发生了突变（表2）。

表 2

3.6 WGCNA和AML预后相关模块的鉴定

WGCNA是一种系统的生物学方法，它根据基因表达模式的相似性将基因分为不同的簇或模块，可以用来分析基因的潜在功能。为了确定AML预后相关模块，我们基于基因表达谱和生存信息(包括OS时间、OS状态、EFS时间和EFS状态)对TCGA中的AML患者进行了WGCNA。去除基因表达模式差异较大的样本（图7.a）。我们选择无标度R ² = 0·8作为实现无标度网络的软阈值（图7.b-c）。结果，在动态树切割合并后，共识别出32个基因共表达模块（图7.d）。

图 7

热图绘制了1000个选定基因中的TOM，表明每个模块都是相互独立验证的，并计算各模块与AML患者生存期的相关性（图8.e）。我们确定了两个与OS时间、OS状态、EFS时间和EFS状态(P < 0·05)有统计上显著关联的模块:一个用于肿瘤抑制，另一个用于肿瘤促进。绿色模块与AML患者生存时间呈正相关(Pearson correlation coefficient, OS P = 2 × 10−4; EFS P = 8 × 10−5)，与患者生存状态呈负相关(defining death as the positive event; Pearson correlation coefficient, OS P = 7 × 10−6, EFS P = 6 × 10−6)；红色模块与生存时间呈负相关(Pearson correlation coefficient, OS P = 0·03; EFS P = 0·04)，但与生存状态呈正相关(Pearson correlation coefficient, OS P = 0·01, EFS P = 0·02)，FHL1存在红模块（图8.f）。由于同一模块的基因通常具有相似的生物学功能，我们对与FHL1相同模块的基因进行了分析。这个红色模块包含一些已被报道为AML预后标志物的基因，如CALCRL、DOCK1和HOPX，还包括一些干细胞相关基因，如CD34和FAM30A以及一些转录因子相关基因，如JAK1、SMAD1和Notch1（图8.g）。KEGG富集分析还发现，红色模块基因参与了肿瘤的转录错误调控（图8.h）。TCGA数据的WGCNA显示包含FHL1的模块与AML预后显著相关，对模块相关基因的功能分析提示FHL1可能参与了基因转录和干细胞的调控，可能作为预后的候选标志物。

图 8

3.7 FHL1相关基因在LS标记、癌症通路和化疗药物的细胞外转运中富集

为了探索FHL1表达与肿瘤细胞标记的相关性，我们根据FHL1表达水平对AML患者进行GSEA检测。AML、LSC信号、癌症信号通路(包括Wnt信号通路、MAPK信号通路和JAK/STAT信号通路)、细胞对药物的反应、化疗药物的细胞外转运均显著富集（图9.a-h）。

图 9

为了进一步验证结果，我们检测了151例初发AML患者FHL1与已知的LSC相关基因的相关性，发现FHL1的表达与ADGRG1、FAM30A、CD34、ZBTB46和NYNRIN呈显著正相关，这些基因被报道为LSC信号的重要组成部分（图10.i）。

图 10

此外，FHL1、SMAD3和TCF4在Wnt信号通路中的表达、MEF2C和TAB2在MAPK信号通路中的表达以及IL2RA和JAK1在JAK/STAT信号通路中的表达均呈现明显的正相关（图11.j-l）。

图 11

GSEA结果还显示，FHL1表达相关基因在化疗药物跨膜转运中富集，此外，负责将阿糖胞苷等化疗药物转运出细胞的ABCC1和ABCC4在FHL1高表达组内表达升高（图12.m-n）。

图 12

而在化疗耐药患者中，FHL1的表达与SLC29A1基因呈负相关，SLC29A1基因负责将阿糖胞苷转运入细胞（图13.o）。

图 13

因此，FHL1可能通过减少化疗药物进入细胞的摄取，增加化疗药物排出细胞外，参与AML细胞对化疗药物的耐药。

3.8 FHL1在LSCs中高度表达，其靶向干预增强了阿糖胞苷的细胞毒

性作用

为了进一步阐明FHL1在LSCs中的作用以及AML的化疗耐药，我们将FHL1在FAB-M0(又称微分化急性成髓细胞白血病)中的表达与分化程度较高的FAB-M4和-M5中的表达进行了比较（图14.a）。先前的一项关于正常造血的研究报道称，与它们的子代细胞相比，FHL1在脐血来源的原始造血干细胞(HSPCs)中过表达。因此，我们探究FHL1是否与LSCs有关，发现FHL1在17-gene LSC评分(LSC17)高的细胞中表达增加，LSC17是与干性相关的预后生物标志物（图14.b）。此外，FHL1在AML CD34+细胞中的表达高于AML CD34-细胞（图14.c）。FHL1在LSCs中高度表达，可能参与了LSCs的调控，AML的高复发率归因于LSCs的持续存在，LSCs具有许多与治疗耐药相关的干细胞特征。我们的研究和另一项基于高通量筛选的研究表明，与化疗敏感患者相比，化疗耐药AML患者初始诊断时FHL1表达升高（图14.d）。此外，我们发现FHL1在同一AML患者复发时的表达高于首次诊断时（图14.f）。

图 14

因此，FHL1可能参与了AML的化疗耐药和复发。根据首次诊断时FHL1表达情况，我们将接受以胞嘧啶为基础的标准诱导化疗的AML患者分为两组，生存分析显示FHL1高表达组有较短的OS和EFS（图15.g-h）。FHL1高表达的新AML患者移植后预后也较差（图15.i）。

图 15

我们下调了AML细胞株Kasumi-3和U937中FHL1的表达（图16.j），并检测了这些细胞对阿糖胞苷敏感性的影响。结果显示，两种shRNA敲除FHL1后，与对照组相比，阿糖胞苷对AML细胞的杀伤作用增强（图16.k-l）。我们在AML细胞中过表达FHL1，发现在阿糖胞苷治疗中，FHL1可以提高AML细胞的存活率（图16.m-o）。提示FHL1靶向干预可能提高AML细胞对阿糖胞苷的敏感性。因此，FHL1在初始诊断时的表达水平可能对AML化疗患者的预后评估和针对性干预有帮助。

图 16

4 讨论

本研究发现FHL1是一种强有力的预后指标，独立于现有的临床或遗传因素并与之互补，其高表达暗示较短的生存期和化疗反应较差。此外，FHL1的下调增强了AML细胞对阿糖胞苷的敏感性。因此，FHL1的高表达可以作为临床策略选择的评价因子，其靶向干预可能有利于AML患者的治疗，尤其是化疗耐药的患者。

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