空间转录组SMI助力揭示脂肪肝相关肝癌中的免疫抑制和微环境重塑

题目：Targeting Treg–fibroblast interaction to enhance immunotherapy in steatotic liver disease-related hepatocellular carcinoma

期刊：Gut

IF：25.8

DOI：10.1136/gutjnl-2025-335084

2025年7月，国际权威期刊《Gut》发表了一项由新加坡、德国等多国科学团队联合完成的重磅研究，该研究使用单细胞+多组学深入分析了SLD-HCC的肿瘤微环境，并发现了导致免疫治疗耐药性的关键机制，为未来开发新的治疗策略提供了重要的理论依据。


实验设计与技术手段

本研究纳入了22例SLD-HCC和31例非SLD-HCC患者的样本，采用多组学方法深入探讨肿瘤微环境（TME）的特征。研究重点依托以下技术手段：

单细胞转录组(10x Genomics)：分析患者的肿瘤和非肿瘤组织样本，揭示不同细胞类型之间的互作关系，帮助理解肿瘤微环境中的免疫和代谢特征。

空间转录组(Visium)：对肿瘤组织进行空间转录组分析，描绘肿瘤边缘等关键位置的细胞分布及其分子特征，为揭示肿瘤微环境的空间差异提供关键线索。

空间转录组(CosMx SMI)：通过高分辨率的单细胞空间转录组，探索肿瘤微环境中细胞的邻域关系，进一步细化免疫抑制机制的局部特征。

多种技术手段协同作用，揭示了SLD-HCC的细胞异质性和空间组织特征，并通过CyTOF、多重免疫荧光和小鼠模型进行验证，增强了研究的全面性和可靠性。

主要发现

1.单细胞转录组揭示免疫和脂质代谢通路的显著变化

通过scRNA-seq分析，发现SLD-HCC中调控性T细胞（Tregs）、癌相关纤维母细胞（CAFs）和内皮细胞（ECs）等细胞类型显著上调了脂质代谢相关基因（如APOA2和FABP1），同时Tregs下调了抗原呈递基因（HLA-DRB5）和激活标志物（IL2RA），而CD8+ T细胞则表现出毒性基因（CST7）的下调。这些变化表明，高脂肿瘤微环境驱动了细胞的代谢适应，从而引发整体免疫抑制状态。

单细胞转录组揭示SLD-HCC TME的脂质代谢与免疫变化

（A）研究设计的示意图。（B）点图显示每个细胞簇中表达量最高的基因。点的颜色表示平均表达水平，点的大小表示细胞的百分比。（C）UMAP图显示65606个单细胞的Louvain聚类。（D）条形图显示主要细胞类型在肿瘤和非肿瘤组织之间的分布（左侧），在SLD-HCC和非SLD-HCC患者之间的分布（中间），以及总细胞数（右侧）。（E）点图显示富集的基因本体论通路，比较SLD-HCCs与非SLD-HCCs之间的差异表达基因（DEG）。点的颜色表示在SLD-HCCs与非SLD-HCCs之间的富集情况，点的大小表示通过Benjamini-Hochberg方法调整后的p值。（F）火山图描绘了与非SLD-HCCs相比，SLD-HCCs中的调节性T细胞（Tregs）、CD8阳性T细胞、成纤维细胞和内皮细胞中显著上调（红色）或下调（绿色）的代表性基因。使用Wilcoxon秩和检验进行差异表达基因分析，并进行对数转换，调整后的p值<0.05被认为具有显著性。（A-F）数据来自SLD-HCC（n=5）和非SLD-HCC（n=6）患者的肿瘤和非肿瘤邻近肝组织。


2.Visium空间转录组描绘Treg-CAF簇的空间组织特征

Visium数据显示，在SLD-HCC的肿瘤边缘，免疫细胞与纤维母细胞高度共定位，形成了一个免疫抑制的微环境区域。进一步的解卷积分析发现Treg-CAF簇显著富集.。同时， TNFSF14–TNFRSF14（肿瘤坏死因子超家族成员与其受体）的交互强度增强，进一步推动了肿瘤细胞的免疫逃逸。

Visium空间转录组解析SLD-HCC边缘Treg-CAF簇

（A）Visium空间转录组学（ST）的数据分析流程。（B）UMAP图展示经过Harmony整合后的ST数据分布。包含来自7例SLD-HCC和5例非SLD-HCC的126099个点。（C）UMAP图显示所有Visium数据中主要免疫和非免疫亚群的基因特征评分。（D）来自SLD-HCC和非SLD-HCC患者的FFPE组织样本的代表性H&E染色图像，包括肿瘤、非肿瘤和边缘区域（左）；使用SpaCET进行空间反卷积，指示肿瘤和非肿瘤区域（右）。框，视野（FOV）=6.5×6.5毫米。（E）使用Banksy进行空间感知聚类，显示每个组织样本内的不同区域。（F）热图显示用于估计每个区域内细胞组成的相对基因特征评分。


3.CosMx SMI空间转录组揭示Treg-CAF交互驱动免疫疗法抵抗

通过CosMx SMI分析发现，SLD-HCC中Tregs与CAFs呈现出显著的邻域富集（涉及25种细胞类型），并伴随HLA-E（人类白细胞抗原E，抑制免疫细胞活性）等抑制分子的上调。结合细胞通讯分析，发现TNFSF14-TNFRSF14轴在早期前体阶段已启动激活，与CD8+ T细胞的耗竭以及Tregs的积累密切相关，从而加剧了肿瘤对免疫疗法的抵抗。

CosMx SMI描绘SLD-HCC Treg-CAF免疫抑制网络

（A）与CosMx无监督聚类生成的空间转录组学（ST）数据相匹配的代表性免疫荧光（IF）图像。每个聚类都有颜色编码。PanCK，泛细胞角蛋白。每个视野（FOV）=0.7×0.9毫米。（B）UMAP图展示来自两例SLD-HCC和两例非SLD-HCC的50个FOVs中的总共152214个细胞的所有聚类。（C）热图显示代表每个CosMx聚类的选定基因的相对表达水平。（D）条形图显示在两例SLD-HCC和两例非SLD-HCC组织样本中，每种已识别细胞类型的绝对数量（上）和在总细胞内的比例（下）。（E）邻域富集分数显示CosMx ST数据中Tregs与其他细胞类型之间的相互作用强度。通过成对Mann-Whitney检验计算双侧P值。（F）邻域富集分数显示从反卷积的Visium ST数据中，在边缘区域Tregs与成纤维细胞之间的相互作用强度（n=7例SLD-HCC和n=5例非SLD-HCC）。通过成对Mann-Whitney检验计算双侧P值。（G）代表性IF图像显示SLD-HCC和非SLD-HCC组织边缘区域的CD4、FoxP3（Treg）和αSMA（成纤维细胞）染色。DAPI用于细胞核染色。比例尺表示20微米。（H）比较SLD-HCC和非SLD-HCC之间Tregs的平均数量，这些数据是从每个组织的肿瘤边缘随机选择的三个到五个FOVs中定量得出的。（I）比较（H）中相同FOVs中Treg与最近成纤维细胞之间的距离，在SLD-HCCs和非SLD-HCCs之间进行比较。（F、H和I）箱线图显示中位数，须线代表最小值和最大值，箱边显示第一和第三四分位数。（H和I）多重免疫荧光（mIF）数据来自六例SLD-HCCs和六例非SLD-HCCs，分析使用Mann-Whitney U检验进行。图表显示平均值±标准误。


4.构建免疫演化模型并验证治疗潜力

单细胞和空间转录组共同勾勒出SLD-HCC从免疫监视向免疫抑制转变的连续路径。验证实验表明，在高脂饮食诱导的HCC小鼠模型中，阻断TNFRSF14不仅减少了Tregs，还提升了活性CD8+和记忆CD4+ T细胞的水平，并与anti-PD-1（抗PD-1免疫检查点抑制剂）疗法产生协同效应，最终缩小肿瘤体积。研究证实了该信号轴作为免疫疗法抵抗的关键驱动因素。

小鼠模型验证TNFRSF14阻断与anti-PD-1协同疗效

（A）小鼠喂食高脂饮食（HFD）7周，并通过原位注射Hepa1–6细胞到肝脏建立肝细胞癌（HCC）模型。小鼠随机分为四组接受治疗，从第5天到第19天每两周治疗一次，持续2周（每组4-5只小鼠）。（B）测量每只小鼠的肿瘤体积（（长度×宽度²）/2，单位为mm³）。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验计算双尾P值。（C）显示肝脏的代表性图像。（D）在不同治疗条件下小鼠肿瘤组织中T细胞亚群的比例（%）。通过双尾Student t检验计算P值。（E）点图显示与对照组相比，在不同治疗条件下小鼠肿瘤组织中差异表达基因（DEGs）富集的基因本体论（GO）通路。点的颜色表示对数转换后的调整P值，点的大小表示富集倍数。（F）测量正常饮食小鼠的肿瘤体积（（长度×宽度²）/2，单位为mm³）。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验计算双尾P值。（A-E）同型抗体对照组和抗PD-1治疗组各有4只小鼠；抗TNFRSF14和抗PD-1+抗TNFRSF14联合治疗组各有5只小鼠。（B、D和F）图表显示平均值±标准误。


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